海口市海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染情况监测分析

陈 晨，庞 燕，邵仁杰，李雪霞，夏乾峰

（1.海南医学院公共卫生与全健康国际卫生学院，海南 海口 571199；2.海南医学院热带转化医学教育部重点实验，海南 海口571199；3.海口市疾病预防控制中心，海南 海口 571199；4.海南医学院热带医学院，海南 海口 571199）

海南作为热带岛屿地区，是国内海产品最丰富的省份之一。其中海口作为省会城市，日常生活中承担了290 万人口的海产品饮食所需。海口市海产品丰富多样，也不乏一些细菌会存在于海产品中，常见的包括副溶血性弧菌和溶藻弧菌。副溶血性弧菌是一种革兰阴性嗜盐杆状细菌，广泛分布于多种海产品中，包括鱼类、贝类、头足类、虾蟹类等［1］。根据现有的研究报道，绝大部分副溶血性弧菌的感染与食用海产品有关［2］。若食用了被副溶血性弧菌污染的、且未完全煮熟的海鲜可导致急性胃肠炎，同时伴有恶心、头痛和低烧等症状［3］。溶藻弧菌是一种专性寄生于嗜盐对虾等海洋生物中的细菌［4］，可直接感染人类。人们可能通过接触疫水或食用被污染的海产品感染，可引起严重的软组织感染、败血症和其他肠道外感染［5］。近年来的研究也证实了副溶血性弧菌和溶藻弧菌是沿海地区腹泻病的常见病原菌［6］。此外，中国疾病预防控制中心对2009 年～2018 年的急性腹泻患者的监测显示，食源性弧菌是导致腹泻的重要病原体之一，在所有致腹泻相关病菌中，其所占比例约为10.83%［7］。

目前对于海南地区海产品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染情况的研究较少，本研究探究海南地区海产品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的整体污染情况，为控制海产品的污染控制提供依据，同时为促进公共卫生的防控提供依据。

本研究监测了2020～2022 年期间海口市部分海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的流行情况，旨在为海口市海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染情况提供可靠的数据支撑，有利于提高海产品质量，保护公众健康。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 按照国家食品污染和有害因素风险监测的要求，在海口市所辖个区：龙华区、美兰区、琼山区和秀英区的餐饮、超市、零售店采集119 份海产品；其中虾类10 份，鱼类59 份，贝类50份。每份样本采集500～1 000 g，采集后在4 h 内送实验室检测。以上所有样本资源均由海口市疾控中心人员在2020～2022 年1～12 月所采集。

副溶血性弧菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（DS1400）和溶藻弧菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（DS1430）购自于广州达安生物科技有限公司。3%碱性蛋白胨水、3%氯化钠三糖铁琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备 Incucell ICV 55 ECO 电热恒温培养箱（德国MMM 公司），7500FAST 荧光定量RCR 仪（美国Applied Biosystems 公司），T1000 电子天平（福州华志科学仪器有限公司），SterilGARDⅢ Advance SG403 生物安全柜（美国Baker 公司）。

1.2 方法

副溶血弧菌和溶澡弧菌的分离及鉴定：采用《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7-2013）为标准，进行样本的前处理、增菌分离及鉴定。利用副溶血性弧菌和溶藻弧菌的核酸检测试剂盒，采用实时荧光PCR 技术可疑菌落进行验证鉴定。反应程序：50 ℃ 2 min，95 ℃预变性 15min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 45 s，40 个循环采集荧光。以副溶血弧菌和溶澡弧菌核酸检测试剂盒提供的阳性质控品为阳性对照，阴性质控品为阴性对照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0 软件对数据进行分析，阳性率的比较采用χ2检验，当理论频数≥1 且＜5，则采用Fisher 精确检验，P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的初步分离

对采集的3 大类海产品进行TCBS 初步分离鉴定，结果如图1 所示，TCBS 平板呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，疑似副溶血弧菌；如图2 所示，TCBS 平板呈圆形，大而光滑的黄色菌落，疑似溶藻弧菌。

图1 副溶血弧菌在TCBS 琼脂上的菌落形态Fig 1 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on TCBS agar

图2 溶藻弧菌在TCBS 琼脂上的菌落形态Fig 2 Colony morphology of Vibrio alginolyticus on TCBS agar

2.2 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的确定鉴定

对3 大类海产品中分离疑似副溶血弧菌和溶藻弧菌的菌落进行实时荧光PCR 验证确定，根据副溶血弧菌核酸检测试剂盒的说明，副溶血弧菌的结果判定标准如下，阴性：无扩增曲线或Ct＞38；阳性：Ct≤38 且曲线有明显的扩增曲线。如图3 所示，样品的Ct=12.57，阳性对照为Ct=24.53，阴性对照Ct=40，可以确定该样品为副溶血弧菌。

图3 部分副溶血弧菌Q-PCR 扩增曲线图Fig 3 Q-PCR amplification plot of Vibrio parahaemolyticus

根据溶藻弧菌核酸检测试剂盒的说明，溶藻弧菌的结果判定标准如下，阴性：无扩增曲线或Ct＞38；阳性：Ct≤38 且曲线有明显的扩增曲线。如图4所示，样品的Ct=15.12，阳性对照为Ct=22.73，阴性对照Ct=40，可以确定该样品为溶藻弧菌。

图4 部分溶藻弧菌Q-PCR 扩增曲线图Fig 4 Q-PCR amplification plot of Vibrio alginolyticus

2.3 不同种类海产品中副溶血性弧菌的检出情况

2020～2022 年所采集的海口市市售鱼类、虾类、贝类3 大类的119 份样品中，24 份样品检出副溶血性弧菌，总阳性率为20.1%（表1）。3 大类海产品中均检出副溶血性弧菌，其中虾类中阳性率最高，为50%；50 份贝类样本中，副溶血性弧菌的阳性率为34%；鱼类的阳性率较低。经Fisher 精确检验分析，各类样品中副溶血性弧菌阳性率差异有统计学意义（χ2=23.529，P＜0.05）。

表1 海口市市售海产品副溶血性弧菌的检出情况Tab 1 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou market

2.4 不同种类海产品中溶藻弧菌的检出情况

2020～2022 年所采集的海口市市售鱼类、虾类、贝类3 大类的119 份样品中，46 份样品检出溶藻弧菌，总阳性率为38.7%（表2）。其中贝类的阳性率最高，为48%。经Fisher 精确检验分析，各类海产品中溶藻弧菌阳性率差异无统计学意义（χ2=3.688，P＞0.05）。

表2 海口市市售海产品溶藻弧菌的检出情况Tab 2 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou market

2.5 不同年份海产品中副溶血性弧菌的检出情况

按不同年份统计3 种海产品中副溶血性弧菌的检出情况，2022 年副溶血性弧菌的阳性率最高，为25%（表3）。经卡方检验分析，不同年份海产品中副溶血性弧菌阳性率差异无统计学意义（χ2=1.10，P＞0.05）。

表3 不同年份海口市市售海产品副溶血弧菌的检出情况Tab 3 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou market in different years

2.6 不同年份海产品中溶藻弧菌的检出情况

按不同年份统计3 种海产品中溶藻弧菌的检出情况，其中2021 年溶藻弧菌的阳性率最高，为76.7%（表4）。经卡方检验分析，不同年份海产品中溶藻弧菌阳性率差异有统计学意义（χ2=42.573，P＜0.05）。

表4 不同年份海口市市售海产品溶藻弧菌的检出情况Tab 4 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou market in different years

2.7 不同季度海产品中副溶血弧菌检出情况

按不同季度统计3 种海产品中副溶血弧菌的检出情况，第4 季度副溶血弧菌的阳性率高，为32.8%，第3 季度未检出副溶血弧菌（表5）。经Fisher 精确检验分析，不同季度海产品中溶藻弧菌阳性率差异有统计学意义（χ2=61.645，P＜0.05）。

表5 不同季度海口市市售海产品副溶血弧菌的检出情况Tab 5 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou city by quarters

2.8 不同季度海产品中溶藻弧菌的检出情况

按不同季度统计3 种海产品中溶藻弧菌的检出情况，其中第2 季度溶藻弧菌的阳性率最高，为80%，第1 季度和第3 季度均未检出溶藻弧菌（表6）。经Fisher 精确检验分析，不同季度海产品中溶藻弧菌阳性率差异有统计学意义（χ2=48.677，P＜0.05）。

表6 不同季度海口市市售海产品溶藻弧菌的检出情况Tab 6 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou city by quarters

3 讨论

海口作为沿海旅游城市，不仅为常住居民供应海产品，还为旅行者提供大量海产品，销量巨大，同时大量的常住居民有喜食生腌海鲜的习惯。因此，海产品的安全性值得重点关注。一项最新研究报道，海口市由副溶血性弧菌引起的食源性疾病在逐渐增长［8］。本研究中2020～2022 年海产品中副溶血性弧菌阳性率为21.0%，是低于李平等［8］关于海口市2014 年～2016 年副溶血性弧菌阳性率（41.4%）。阳性率的下降与相关部门的监督息息相关，说明增加海产品的监管力度，提倡低温存储是十分重要的。4 个季度中，虽然第一季度阳性率最高，但是由于样本量太小不具有代表性。除第1 季度外，第4季度的阳性率很高，这与倪云龙等［9］研究一致。温度是影响海产品副溶血性弧菌污染的主要因素之一［10］。海口气温较高，为细菌生长提供了适宜的环境，尤其是在第2 和第3 季度［11］。海产品低温存储有效减少了副溶血性弧菌的感染风险。第2 和3 季度的海产品低温存储到位，但到第4 季度气温下降，常温存储的海产品的会成为滋生副溶血性弧菌的温床，导致阳性率增加。在3 类海产品中，虽然虾类的阳性率最高，但是由于样本量太小不具有代表性。除虾类之外，贝类的阳性率很高，与宫春波［12］和Yu 等［13］报道一致。不同产品的阳性率不同可能是由于生活区域及生活习性不同，导致对污染物的富集程度不同［14］。海口市售的海产品来源于人工规模养殖及海底捕捞，各年度样品中副溶血性弧菌阳性率的差异无统计学意义，这与李平的研究报道一致［8］。

本研究中2020～2022 年在海产品中溶藻弧菌阳性率为37%，高于广州（20.31%）和昆明（17.4%），低于厦门（81.4%）［15-17］。说明海口市海产品溶藻弧菌的携带率比较高，应该引起监管部门的重视。其中贝类的阳性率最高，与翁琴云等［17］报道一致，与贝类的生活习性及密切相关。各年份样品中溶藻弧菌阳性率的差异有统计学意义，且在2021年存在高峰感染，说明2021 年海水的水质污染情况较为严重。各季度的溶藻弧菌阳性率的差异有统计学意义，第2 季度的溶澡弧菌阳性率最高，在该季度需要特别关注海产品的安全问题，加强监管。

总体而言，海口市副溶血性弧菌和溶藻弧菌的阳性率比其他省份稍高，与样品类别相关。有研究表明，温度对于弧菌的生长十分重要［18］。高温利于弧菌生长繁殖，海口地处热带地区，常年高温，会增加弧菌的阳性率。海产品的存储管理需要根据不同的季节与气温变化灵活调整，以确保其质量与安全。监管机构应该更加意识到弧菌感染的风险，并提出适当的控制措施。为了预防消费者收到海产品相关弧菌的感染，消费者在购买海产品时应该选择优质、新鲜的海产品，若购买的是包装类的海产品，应购买符合食品安全标准并在保质期内的产品。在食用贝类海产品前，应彻底煮熟，以确保可能存在的副溶血性弧菌和溶藻弧菌等致病微生物被有效杀灭［19］。

作者贡献度说明：

陈晨：数据整理、写作原稿；庞燕：收集数据和实验；邵仁杰：数据整理及实验；李雪霞：提供研究思路，修改原稿；夏乾峰：提供资金、资源及监管。

所有作者声明不存在利益冲突关系。