针刺对穴“迎香-合谷”对变应性鼻炎大鼠Th1、Th2 细胞因子及转录因子T-bet/GATA-3 的影响

2023-08-21苏嘉琪楼金成苗镡允吉美奇翟春涛郝重耀吕玉娥

海南医学院学报 2023年15期

胡情，苏嘉琪，楼金成，苗镡允，尹浩，吉美奇，翟春涛，郝重耀，吕玉娥，

（1.山西中医药大学，山西晋中 030600；2.山西省针灸医院，山西太原 030006）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，是一种由免疫球蛋白E（IgE）介导的、以2 型辅助T 细胞（type 2 helper T cell，Th2）免疫反应为主的鼻黏膜非感染性慢性炎症性疾病，临床主要表现为阵发性喷嚏、流清涕、鼻塞鼻痒等，严重者甚至出现嗅觉减退等［1］。AR 的发病与环境暴露、遗传、气候变化和生活方式等多方面因素有关，屋尘螨、霉菌、动物皮毛是其主要的致敏来源［2-4］。近年来该病在中国的患病率一直呈上升趋势［5］。AR 的患病人群从儿童到成年人均易发生，约有19%～38%的AR 患者伴有哮喘［6］，还易导致睡眠障碍，给患者的社会生活、学习和工作带来极大痛苦［7］。AR 易反复发作，临床上治疗AR 主要有药物治疗、免疫治疗、环境控制、健康教育等［8］。针刺治疗AR 具有一定优势［9］，越来越受到人们的关注。目前主要认为其发病机制主要为Th1/Th2、Th17/调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）细胞间的免疫失衡［10］，其中，Th1、Th2 失衡被认为是AR 发生的基础［11］，因此治疗AR 的关键在于调整Th1/Th2 细胞的比例、恢复Th1/Th2 之间的免疫平衡。“国医大师”吕景山教授在AR 的诊治方面有丰富的临床经验，通过运用针刺对穴“迎香-合谷”在临床治疗AR 中取得了显著疗效，且复发率低，能有效提高患者治疗后的生活质量［12］，但针刺对穴治疗AR 的作用机制尚不明确，以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）构建AR 大鼠模型能较好地模拟AR 的临床症状，因此本研究主要从Th1、Th2 细胞间的免疫平衡入手，通过构建OVA AR 大鼠模型，观察针刺“迎香-合谷”对穴对AR 大鼠Th1、Th2 细胞因子及转录因子T-bet/GATA-3 的影响，探讨对穴干预AR 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF 级SD 大鼠30 只，雌雄各半，4～6 周龄，（200±40）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，［许可证号：SCXK（京）2019-0010］。饲养于山西中医药大学科研楼针灸针法实验室，温度20～23 ℃，湿度40%～60%。适应性喂养7 d 后将大鼠按1-30 编号，采用随机数字表法将大鼠随机分为空白组、模型组、对穴组3 组（10 只/组）。空白组正常喂养不造模，其余2 组均进行造模。实验过程中均遵守动物伦理原则，本研究经山西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号：AWE202209144）。

主要仪器与试剂卵清蛋白（OVA，A5503，美国sigma 公司）；氢氧化铝干粉（［Al（OH）3］，A800854，上海基屹生物科技有限公司）；Rat（IgE）（W20015413）、Rat（IL-5）（W20015414）ELISA 试剂盒，华美生物；IL-4（L220715832）、IL-12（L221010663）ELISA 试剂盒，优尔生生物；Rat IFN-γ（A38020124）、Rat IL-2（A30211236）、Rat IL-6（A30611235）ELISA 试剂盒，联科生物。Actin一抗，（Actin 一抗，1∶3 000，GB15003）、二抗HRP-山羊抗兔（1∶5 000，GB23303），Servicebio 公司；GATA-3 一抗（1∶1 000，AF6233），Affinity 公司；T-bet 一抗（1∶1 000，ab91109），Abcam 公司。

酶标仪（BioTek，型号∶Eproch）；台式高速冷冻离心机（大龙，D3024R）；研磨仪（Servicebio 公司，KZ-Ⅱ）；转印电泳仪（Servicebio 公司，SVT-2）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝，JY92-11N）；扫描仪（EPSON 公司，V370）；正置光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；图像分析软件（Adobeg 公司，Adobe PhotoShop）；成像系统（日本尼康，NIKON DS-U3）；一次性无菌针灸针（规格∶0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）。

2 方法

2.1 造模方法

参照文献［13，14］造模方法，AR 造模共分为3个阶段，（1）基础致敏：将0.3 mg OVA +30 mg Al（OH）3+1 mL 生理盐水制成混悬液以备用，模型组、对穴组每只大鼠均进行腹腔注射，空白组用不含OVA 的混悬液替代，隔日1 次，共7 次；（2）强化激发：第14～20 d，以每侧 5% OVA 生理盐水混悬液50 μL 滴鼻，空白组以等量生理盐水替代滴鼻，每日1 次，共7 d；（3）模型维持：第21～30 d，每次干预结束30 min 后给予每侧5% OVA 氯化钠溶液混悬液20 μL 滴鼻，空白组以等量生理盐水替代滴鼻，每日1 次，共10 d。（注：因AR 属于变态反应性疾病，造模后机体为致敏状态，但只有在接触变应原后才会触发变态反应，因此造模成功后仍需进行模型的维持）

2.2 模型评价

最后1 次激发结束30 min 后对大鼠鼻敏感症状进行观察评分，若累积总分≥5 分，则提示造模成功。

2.3 干预方法

造模结束后第2 天（即第22 天）开始进行干预。空白组正常喂养，不干预。对穴组于每次激发前对“迎香-合谷”穴位行针刺干预，迎香、合谷穴的定位参照郭义［15］主编的《实验针灸学》“动物针灸穴位图谱”有关内容。迎香穴：大鼠直视时，鼻孔外侧与眼球中心交界处，即大鼠两鼻孔外侧约3 mm，皮肤毛交界处；合谷穴：位于大鼠前肢第一与第二掌骨之间，当第2 掌骨桡侧缘的中点处。具体操作为：将大鼠套上防咬环后绑缚固定，穴区常规消毒，合谷穴直刺进针，迎香穴斜刺进针，深度约为0.3 cm，留针20 min，合谷穴同步行针，10 min/次，每日1 次，共10 d，模型组同对穴组一样绑缚20 min，不予针刺。

2.4 行为学观察评分

于造模前、后及最后一次干预结束、鼻部激发后采用症状叠加量化计分法［16］观察大鼠鼻部过敏症状并进行评分，评分标准详见表1。

2.5 取材

于干预结束第2 天取材。大鼠称重、腹腔注射麻醉（3% 30 mg/kg 戊巴比妥钠）后采血，静置后离心15 min（3 000 r/min），取上清至冻存管。然后用注射器经后鼻道推注生理盐水灌洗鼻腔，同时用1.5 mL EP 管在鼻孔处收集灌洗液。随即剥离大鼠双侧鼻黏膜组织，一侧置于4%中性多聚甲醛溶液中固定，另一侧锡纸包裹液氮速冻后转存至-80 ℃冰箱。

2.6 鼻黏膜组织形态学观察

取固定好的鼻黏膜组织依次经脱水、包埋、烤干后二甲苯透明、脱蜡水洗后进行HE 染色，中性树胶封片，镜下观察组织形态学病理改变。

2.7 鼻腔灌洗液涂片EOS 计数

将鼻腔灌洗液离心3 000 r/min，10 min，沉淀物涂片，干透后固定，石蜡划线后滴加瑞氏染液，静置1 min，滴加PBS 缓冲液，5 min 后流水冲洗，待干透后镜检进行EOS 计数。

2.8 ELISA 检测大鼠血清总IgE、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-6 水平

将收集的血样本离心3 000 r/min，10 min，取上清，放4 ℃冰箱，待测。然后按照试剂盒说明书步骤分别检测大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-6 含量。

2.9 Western blot 检测大鼠鼻粘膜组织T-bet 、GATA-3 蛋白水平

取鼻黏膜组织加入裂解液匀浆提取蛋白，配制SDS-PAGE 上样电泳，电泳至溴酚蓝里最底部约1 cm 后300 mA 恒流转膜30 min（湿转），转印后清洗并加入脱脂牛奶脱色，室温封闭后加入一抗（GATA-3 1∶1 000；T-bet 1∶1 000；Actin 1∶3 000），4 ℃过夜，洗膜后加入二抗（HRP-山羊抗兔 1∶5 000），室温孵育后再次洗膜，ECL 溶液发光显影，扫描胶片存档，采集图片，分析各组蛋白条带。

2.10 免疫组化检测大鼠鼻黏膜中T-bet 、GATA-3的表达情况

鼻黏膜组织石蜡切片依次脱蜡至水，自然冷却后在脱色摇床上洗涤，在组化圈内滴加3% BSA，室温封闭，滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜；滴加二抗，室温孵育后PBS 水洗3 次；滴加DAB显色液，棕黄色即为阳性区域，自来水冲洗切片终止显色；复染后分化液分化、返蓝，流水冲洗、脱水透明，中性树胶封片。在白光显微镜下进行结果判读。（苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显色的阳性表达为棕黄色）。

2.11 统计学处理

各项实验数据采用统计软件SPSS26.0 进行统计学分析处理；采用Image Pro Plus7.0 进行分析各组免疫组化结果平均吸光度；各组实验数据统计图采用GraphPad Prism 8.0 软件作图处理；数据资料均用均数±标准差（±s）表示；经正态和方差齐性检验后，采用One-Way ANOVA 进行均数比较，用LSD-t 检验进行组间比较，当P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠造模前后及干预后体质量比较

造模前，各组大鼠体质量差异不具有显著性（P＞0.05）；造模后，与空白组同期相比，造模各组体质量显著下降（P＜0.05）；针刺干预后，与模型组同期相比，对穴组大鼠体质量明显上升（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠造模前后及干预后体质量比较（g，n=10，±s）Tab 2 Comparison of body mass of rats in each group before and after modeling and intervention （g，n=10，±s）

注：与空白组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，△P＜0.05。

干预后295.44±6.50 225.93±6.87*254.74±9.09△0.03组别空白组模型组对穴组P造模前235.85±2.39 233.38±4.05 219.78±6.52＞0.05造模后241.41±4.82 208.37±7.17*204.38±5.81*0.02

3.2 大鼠鼻部症状积分比较

造模后，除空白组外各组大鼠均有鼻部过敏症状，模型组总分＞5 分，提示造模成功；最后1 次干预后30 min 内再次评分，与模型组比较，对穴组AR 症状行为学总分明显降低，且小于5 分（P＜0.05）；与空白组比较，对穴组症状积分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠鼻部症状积分比较（n=10，±s）Tab 3 Comparison of nasal symptom scores among different groups of rats（n=10，±s）

注：与空白组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，△P＜0.05。

干预后0.40±0.52 6.10±0.99*0.80±0.92△0.02组别空白组模型组对穴组P造模前0.30±0.48 0.40±0.52 0.20±0.42＞0.05造模后0.40±0.70 6.20±1.03*5.80±0.63*0.02

3.3 鼻黏膜组织形态学观察

镜检示空白组鼻黏膜结构完整，纤毛密集，排列整齐，无明显炎症细胞浸润；模型组鼻黏膜结构明显破坏，纤毛排列不连续，参差不齐，局部充血肿胀，上皮细胞大量脱落坏死，杯状细胞增生，有明显炎症细胞浸润。对穴组鼻黏膜病理程度较模型组明显减轻，结构相对完整，未见明显充血水肿，纤毛整齐，少量脱失，上皮细胞排列整齐、分布均匀，未见明显杯状细胞增生，有少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织HE 染色结果图（×200）Fig 1 HE staining results of nasal mucosa tissues of rats in each group（×200）

3.4 鼻腔灌洗液细胞涂片EOS 计数

与空白组比较，模型组EOS 数量明显增多（P＜0.05），对穴组差异不具有显著性（P＞0.05）；与模型组比较，对穴组、EOS 计数明显减少（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠鼻腔灌洗液涂片EOS计数情况比较（n=10，±s）Tab 4 Comparison of EOS counts on nasal lavage fluid smears of rats in each group（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

EOS 计数（个）2.92±1.30 89.39±14.25*9.68±3.09△0.000 2组别空白组模型组对穴组P

3.5 血清IgE、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-6含量比较

与空白组比较，模型组大鼠血清中的IgE、IL-4 、IL-5、IL-6 含量显著升高，而IFN-γ、IL-2、IL-12 水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，对穴组大鼠血清中的IFN-γ、IL-2、IL-12 含量显著升高，IgE、IL-4、IL-5、IL-6 水平明显下降（P＜0.05）；与空白组相比，对穴组各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、6。

表5 大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-2、IL-12 含量比较（n=10，±s）Tab 5 IgE，IFN-γ、IL-2 and IL-12 levels in serum of rats（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

IL-12（pg/mL)3.31±0.54 0.45±0.14*2.70±0.37△0.000 2组别空白组模型组对穴组P IgE（ng/mL）21.00±2.01 86.18±4.59*36.77±10.11△＜0.000 1 IFN-γ（pg/mL)227.16±34.44 80.00±18.23*182.96±7.15△0.000 6 IL-2（pg/mL)289.07±41.45 98.91±5.70*294.73±27.57△0.000 3

表6 大鼠血清IL-4、IL-5、IL-6 含量比较（n=10，±s）Tab 6 Comparison of IL-4，IL-5，and IL-6 levels in serum of rats （pg/mL，n=10，±s）

组别空白组模型组对穴组P IL-4 63.07±2.84 134.25±24.90*83.99±6.92△0.003 0 IL-5 24.99±7.09 97.18±12.24*37.11±8.04△0.000 2 IL-6 61.17±11.01 161.35±21.70*83.69±7.30△0.000 4

表7 大鼠鼻黏膜T-bet 、GATA-3 蛋白表达比较（T-bet/Actin，GATA-3/Actin，±s）Tab 7 Comparison of T-bet and GATA-3 protein expression in nasal mucosa of rats（T-bet/Actin，GATA-3/Actin，±s）

组别空白组模型组对穴组P T-bet 0.55±0.11 0.19±0.04*0.58±0.12△＜0.000 1 GATA-3 0.58±0.05 1.05±0.10*0.74±0.08△0.000 6

表8 各组大鼠T-bet、GATA-3 平均吸光度比较（n=10，±s）Tab 8 Comparison of average absorbance of T-bet and GATA-3 in each group of rats（n=10，±s）

组别空白组模型组对穴组P T-bet 57.16±2.40 6.84±1.19*52.96±4.02△＜0.000 1 GATA-3 24.99±7.09 97.18±12.24*37.11±8.04△0.000 3

3.6 大鼠鼻黏膜特异性转录因子T-bet 、GATA-3蛋白表达情况

与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜中的GATA-3 蛋白水平显著升高，而T-bet 水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，对穴组大鼠T-bet 蛋白表达明显升高，而GATA-3 水平显著降低（P＜0.05）。与空白组相比，对穴组T-bet 、GATA-3 蛋白表达差异不具有显著性（P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠鼻黏膜T-bet 、GATA-3 蛋白表达Fig 2 Comparison of T-bet and GATA-3 protein expression in the nasal mucosa of rats in each group

3.7 免疫组织化学染色法检测大鼠鼻黏膜中T-bet 、GATA-3 的阳性表达情况

棕黄色的部分为阳性表达区域棕黄色的部分为阳性表达区域。（1）从T-bet 阳性表达情况看，空白组大鼠鼻黏膜固有层炎症细胞胞质内可见棕黄色区域，提示正常鼻黏膜组织中T-bet 表达程度较高；模型组棕黄色染色范围较小，T-bet 表达程度较低；对穴组可见阳性表达范围较大，T-bet 表达程度较模型组高。（2）从GATA-3 阳性表达情况看，GATA-3 在胞质内表达较多，空白组大鼠鼻黏膜组织在固有层中有较小范围的棕黄色区，且染色较浅，这说明在正常鼻黏膜组织中GATA-3 表达较少；模型组大鼠鼻黏膜组织在固有层炎症细胞胞质内有大面积阳性区域，且颜色较深，呈棕褐色，GATA-3表达程度较高；对穴组大鼠鼻黏膜组织固有层可见

较少面积的棕黄色区域，颜色较浅，GATA-3 呈低表达。（3）从平均光密度来看，模型组GATA-3 平均吸光度较空白组明显提高，T-bet 则明显下降（P＜0.05），对穴组T-bet、GATA-3 的阳性表达无显著性差异（P＞0.05）；与模型组相比，对穴组的GATA-3平均吸光度明显降低，T-bet 表达量明显增加（P＜0.05）。见图3、4。

图3 各组大鼠鼻黏膜组织中T-bet 阳性表达结果比较Fig 3 Comparison of T-bet positive expression results in nasal mucosa tissues of rats in each group

图4 各组大鼠鼻黏膜组织中GATA-3 阳性表达结果比较Fig 4 Comparison of GATA-3 positive expression results in nasal mucosa tissues of rats in each group

4 讨论

AR 又称过敏性鼻炎，中医根据其临床表现，把它归于“鼻鼽”、“鼽嚏”等范畴。“鼻鼽”这一病名出自《素问·脉解篇》：“所谓客孙脉…阳明并于上，故头痛、鼻鼽、腹肿也［17］。”在穴位选择方面，针灸治疗变应性鼻炎多以局部取穴和远端取穴配伍为主，在经络选择上主要以阳经上的穴位为主，并提倡配穴方式的多样化［18～20］。“对穴”是国医大师吕景山教授在其师京城名医--施今墨先生“对药”理论的影响下，经过多年的临床实践探索，系统总结得出，具有广泛的临床基础。吕老在临床上运用针刺对穴“迎香-合谷”治疗AR 取得了显著疗效，广受患者好评［21］。迎香穴是针灸治疗鼻病的要穴，《针灸甲乙经》云：“鼻鼽不利，窒气塞，僻，多涕，鼽衄有痈，迎香主之。”迎香穴位居鼻旁，属局部取穴，穴下为面动静脉及面神经与眶下神经的吻合支分布，刺之能宣利鼻窍，恢复嗅觉，且迎香属手、足阳明经交会穴，故可通调两经之气、祛风通窍，改善鼻部微循环，使鼻部畅通，并能疏通其表里经--肺经之气，使肺的宣降之力增强，肺气通于鼻，故又能通鼻窍。研究表明在迎香穴处运用针刺［22］、穴位注射［23～24］、穴位敷贴［25］、埋线［26］等治疗AR 均取得了满意效果。其原因可能与针刺迎香穴能恢复鼻黏膜组织纤毛层的清除功能有关。合谷穴位于手背，在第二掌骨桡侧的中点，为远部取穴，是手阳明大肠经之原穴，有开泻阳明，疏风解表，清泻肺气之功，治疗多种疾患，主要以外感时邪，头面五官等疾病为主。《针灸大成》中“面口合谷收”指出合谷穴可治疗面、口部诸多疾病。手阳明大肠经与手太阴肺经相表里，肺主皮毛，主外感表证诸疾，迎香主要以疏通鼻部经气为主，合谷以宣通经脉之气为要，二穴相配，一上一下，开窍启闭之功益彰［27］。李凌鑫等［28］的研究结果表明针刺合谷穴后局部与对侧面部迎香穴区体表红外热像温度变化具有相关性，提示经脉循行路线具有特异性。郑美凤等［29］的研究表明针刺迎香、合谷能可调节失衡的神经递质功能从而缓解AR 症状，但迎香-合谷配伍治疗AR 的具体机制尚不明确。

研究认为以Th2 免疫反应占优势所引起的Th1/Th2 免疫失衡被认为是AR 发病的基础［30］，而Thl/Th2 比例失衡则表现为相关细胞因子的变化，如IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-5 等。因此抑制Th2 型细胞因子的产生，调节Th1、Th2 相关细胞因子和转录因子的平衡，可能是治疗AR 的关键［31］。IgE 能使肥大细胞和BAS 脱颗粒，并释放多种炎症介质，加剧炎症反应，在AR 的发病机制中发挥着重要作用［32］。IFN-γ、IL-2、IL-12 作为Th1 细胞因子，在降低BAS等的免疫活性的同时，能降低IgE 的生成，抑制肥大细胞脱颗粒，从而起到抑制Th2 免疫驱动，促进Th1型细胞分泌增多的作用，使得Th1/Th2 的免疫平衡得到进一步的调节，进而减缓AR 的进程［33～38］。IL-4、IL-5、IL-6 为Th2 型细胞因子，通过促进IgE 的合成与分泌，刺激肥大细胞、增强EOS 的增生与浸润，在Th1/Th2 免疫平衡中主要起促炎作用，抑制Th1 型细胞因子IL-2、IL-12 和IFN-γ 等的表达，阻止其参与Th0 细胞分化为Th1 细胞的过程，从而增强以Th2 为主要特征的炎症反应的发生和进展［39，40］。Th2 特异的转录因子GATA-3 主要影响Th2 型细胞因子的转录，在促进IL-4 分泌、抑制IFN-γ 产生的同时，阻止原始T 细胞分化成Th1 细胞，使机体处于以Th2 细胞优势免疫应答为主的变态炎症反应状态，从而出现AR 的临床症状［41］。T-bet 是Th1 型细胞分化的特异性转录因子，能促进IFN-γ 产生，诱导Th2 细胞分化为Th1 型细胞，使Th2 型细胞因子比例降低，从而起到抑制炎症反应的作用［42］。

本实验研究结果显示，造模后大鼠鼻部症状评分明显升高，且均＞5 分，提示造模成功，且模型组大鼠血清中Th1 相关细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平明显降低，Th2 细胞因子IL-4、IL-5、IL-6 水平显著升高，进一步验证了Th1/Th2 免疫失衡参与了AR 的发病过程，这与以往的研究结果一致［43］。针刺对穴“迎香-合谷”干预后，对穴组AR 大鼠行为学评分明显下降，且＜5 分，鼻腔灌洗液中EOS 计数明显减少，大鼠鼻黏膜组织炎症浸润情况明显好转，鼻黏膜GATA-3 表达明显降低、T-bet 水平显著，Th1 细胞IFN-γ、IL-2、IL-12 水平明显升高，Th2 细胞因子IL-4、IL-5、IL-6 水平明显降低，纠正了Th1/Th2 细胞间的免疫失衡，从而缓解了局部炎症反应。因此，针刺对穴“迎香-合谷”的干预作用可能是通过降低Th2 特异性转录因子GATA-3 的水平，阻止Th0 细胞分化成Th2 细胞，进而减少Th2 型细胞因子促炎因子IL- 4、IL-5、IL-6 的分泌；同时，提高Th1特异性转录因子T-bet 的表达，促进Th1 细胞分化发挥免疫抑制作用、使Th1/Th2 恢复免疫平衡状态实现的。本研究主要探讨针刺对穴“迎香-合谷”对AR 大鼠Th1/Th2 相关细胞因子及特异性转录因子的影响，阐述了针刺对穴干预AR 的作用机制，给临床提供了一定的循证医学证据。