过表达CTRP6通过调控Nrf2/HO-1通路在减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

沈倩妮,王苏,刘恒娟,李亚男,龚平

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)作为目前缺血性脑卒中的主要防治焦点,其发病机制复杂多样[1]。而伴有糖尿病的患者由于其抗氧化、抗炎能力降低,导致血管脆性增加,更易诱发脑损伤[2]。因此,积极寻找新的治疗方案以减轻糖尿病患者CIRI带来的负担具有重要意义。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-6(C1q/tumor necrosis factor related protein 6,CTRP6)作为CTRP家族的成员,与多种疾病的发生进展密切相关[3]。研究证实,CTRP6可防止多柔比星引起的心脏损伤并激活蛋白激酶B(PKB/AKT)通路[4]。然而CTRP6是否可以通过调控核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)通路进而改善糖尿病小鼠CIRI目前尚未见相关报道。本研究旨在探讨CTRP6调控的Nrf2/HO-1通路在糖尿病小鼠CIRI中的作用,以期为改善糖尿病患者CIRI的预后提供新思路,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物及分组:清洁级健康雄性C57BL/6小鼠18只,9～10周龄,体质量(23±2)g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,饲养于武汉大学动物试验中心SPF环境,给予12 h/12 h光/暗条件(灯亮时间为07:00),湿度(65±5)%,温度(25±1)℃,常规喂养颗粒饲料。随机数字表法分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(IR)、脑缺血再灌注+CTRP6过表达组(IR+CTRP6),各6只。(2)主要试剂:STZ、TTC购自美国Sigma公司,腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-CTRP6购自上海Hanbio公司,Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、IKK、p-IKK抗体购自英国Abcam公司,SOD、CAT、MDA试剂盒购自南京建成公司,IL-1β、TNF-α、MCP-1试剂盒购自美国赛默飞公司,Caspase-3试剂盒购自美国Biovision公司,Caspase-9试剂盒购自上海生工生物公司,ApopTag Plus凋亡荧光试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2 实验方法 2021年9月—2022年6月于武汉大学人民医院进行实验。小鼠糖尿病模型建立:小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg,连续5 d,而后检测其空腹血糖,空腹血糖大于13.9 mmol/L时认为糖尿病模型制备成功。参照文献[5-7],IR+CTRP6组小鼠予STZ后3周接受AAV-CTRP6脑室注射,再过3周后参照文献[8]建立大脑中动脉阻断(MCAO)模型。麻醉小鼠后于颈部正中切口,分离左颈总动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,夹闭颈总动脉远心端,在靠近颈总动脉结扎处插入线栓至稍感阻力后停止,固定线栓并缝合。线栓置入60 min后拔出并恢复灌注。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 小鼠脑梗死面积检测:MCAO后24 h处死小鼠,收集大脑组织并沿冠状位切片(厚度约2 mm)。切片用TTC在37℃水浴箱中孵育30 min,10%福尔马林固定过夜。次日扫描并用Image J软件进行分析。

1.3.2 Western-blot检测Nrf2、NF-κB通路相关蛋白:在含有蛋白酶抑制剂颗粒的RIPA裂解缓冲液中加入脑组织,8%～12%的SDS-PAGE电泳凝胶上分离并转移到PVDF膜上。随后室温下5%脱脂牛奶-PBS阻断2 h,并加入Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、p-IKK、IKK抗体(1∶1 000),4℃下孵育过夜。次日用相应的含HRP的二抗和增强化学发光剂再次孵育,Image J对印迹条带进行量化。

1.3.3 氧化应激及炎性因子检测:取脑组织用预冷的PBS漂洗去除血液,滤纸吸干称重,按比例配置组织匀浆液,离心后取上清置于冰上待测。WST-1法检测SOD,可见光法检测CAT,TBA法检测MDA,ELISA法检测IL-1β、TNF-α、MCP-1水平,严格按试剂盒说明书操作。

1.3.4 Caspase活性及TUNEL染色检测:使用Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒对Caspase活性进行检测,操作步骤严格按说明书进行。根据说明书采用ApopTag Plus原位凋亡荧光素检测试剂盒进行染色,在荧光显微镜下观察并通过Image-Pro Plus软件分析TUNEL阳性细胞数。

2 结 果

2.1 各组小鼠CIRI后脑梗死面积及相关信号通路表达比较 与Sham组比较,IR组Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表达降低,p-NF-κB/NF-κB与p-IKK/IKK水平升高(P<0.01);与IR组比较,IR+CTRP6组脑梗死面积减少,Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表达升高,p-NF-κB/NF-κB与p-IKK/IKK降低(P<0.01),见表1。

表1 各组小鼠脑梗死面积与Nrf2、NF-κB通路相关蛋白表达比较

2.2 各组小鼠CIRI后氧化应激及炎性因子表达比较 与Sham组比较,IR组SOD、CAT活性降低,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表达水平升高(P<0.01);与IR组比较,IR+CTRP6组SOD、CAT活性升高,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表达水平降低(P<0.01),见表2。

表2 各组小鼠氧化应激及炎性因子水平比较

2.3 各组小鼠CIRI后凋亡因子及细胞凋亡表达比较 与Sham组比较,IR组Caspase-3、Caspase-9活性升高,TUNEL阳性细胞数增多(P<0.01);与IR组比较,IR+CTRP6组Caspase-3、Caspase-9活性降低,TUNEL阳性细胞数减少(P<0.01),见表3。

表3 各组小鼠凋亡因子及细胞凋亡比较

3 讨 论

大量证据表明,氧化应激是诱发缺血性脑卒中的重要机制之一,再灌注后氧自由基增多会对细胞造成直接损害,而机体内氧化和抗氧化系统的失衡又可导致多种信号通路的激活[9]。糖尿病患者中过多的活性氧(ROS)可进一步诱发脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤等,同时ROS还可引发后续的瀑布样炎性反应[10]。以上研究表明ROS的产生和炎性介质的累积可触发神经损伤。

研究证实,CTRP6参与了心脑血管代谢疾病的发生进展,亦与胰岛素抵抗和糖尿病密切关联[11]。另有研究认为,CTRP6能对急性刺激做出反应并在营养过剩的情况下发挥作用,通过诱发“生理性炎性反应”以限制脂肪组织扩张[12]。本研究发现再灌注后小鼠脑梗死面积增大,当补充CTRP6后小鼠梗死面积降低。因此进一步探讨CTRP6在CIRI中的具体机制及其与氧化应激和炎性反应的关系,对预防CIRI有重要价值。

Nrf2/HO-1通路作为机体内源性的保护机制,被认为是对抗氧化应激的主要细胞防御手段[13]。本研究发现在糖尿病CIRI后Nrf2/HO-1通路及其下游的NQO-1表达下降,而调控炎性介质的NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化升高,表明再灌注损伤会导致脑组织中氧化应激和炎性反应的升高。新近研究发现,Nrf2和NF-κB之间存在分子串扰现象,在一定程度上可使细胞更精细地调节其对应激的反应,而Nrf2与NF-κB的失衡则会导致多种疾病的发生[14]。当过表达CTRP6后Nrf2/HO-1通路及其下游分子表达增加,机体抗氧化能力增强,NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化降低,机体促炎水平减弱。

在糖尿病状态下,炎性因子作为与缺血性脑卒中密切相关的机制之一,可激活小胶质细胞并招募白细胞分泌细胞因子形成促炎微环境,进一步加剧糖尿病小鼠脑损伤[15]。本研究结果发现,再灌注后小鼠SOD、CAT活性降低,MDA含量升高,而IL-1β、TNF-α、MCP-1的表达增多。过表达CTRP6后氧化应激和炎性因子的积累明显降低,证实CTRP6通过抑制氧化应激和炎性因子的表达在糖尿病CIRI中发挥保护作用。

凋亡作为决定卒中结局的关键因素,其可在脑缺血发生数分钟后启动,并在整个卒中过程中持续存在,抑制神经元的凋亡可有效减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤[16]。研究显示,CTRP6可减轻TNF-α诱导的唾液腺细胞凋亡以及IR损伤诱导的PC12细胞死亡[17-18]。研究发现,CTRP6可通过激活AKT信号通路保护心脏免受阿霉素(DOX)诱导的心肌凋亡[4]。与CTRP6在其他细胞类型中的抗凋亡作用相一致,本研究结果发现,CIRI后Caspase-3与Caspase-9活性升高,同时TUNEL阳性细胞增多,补充CTRP6可降低Caspase的活性,减少凋亡细胞数量。

综上所述,在糖尿病CIRI期间Nrf2/HO-1通路抑制,NF-κB通路激活,进而导致氧化应激、炎性因子、细胞凋亡增加,而过表达CTRP6可显著减轻脑损伤。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

沈倩妮、王苏:实施研究过程,论文撰写;刘恒娟:资料搜集整理;李亚男:分析数据;龚平:课题设计,论文审核