余甘子提取物的化妆品功效研究

鹿王成志 舒小康 吴艳

采用斑马鱼试验，探究余甘子提取物在化妆品中的功效。方法：用过饱和氯化钠溶液处理斑马鱼尾部，使其尾部面积因皱缩而变小，建立保湿功效评价模型；检测胶原基因相对表达量来判断是否拥有抗皱功效；使用经皮吸收的方式进行给样，通过对比斑马鱼体表黑色素含量，检测是否拥有美白功效；观察斑马鱼胚胎自主翻滚次数，检测是否拥有温和无刺激功效。结果：余甘子提取物拥有保湿、抗皱、美白、温和无刺激功效，在化妆品中拥有良好的潜在应用价值。

关键词：斑马鱼；余甘子；化妆品功效；斑马鱼实验

随着经济的发展以及人们健康意识的提高，消费者对纯天然化妆品的需求不断提升。相比于化工原料制造的化妆品，使用天然原料制造的化妆品更受消费者青睐，尤其是使用各种植物提取物为原料的天然化妆品。截至2015年，化妝品已经使用的原料中将近有三分之一属于植物原料[1]，而其中又属植物提取物较受消费者的欢迎。植物提取物含有一定的活性成分[2]，这些成分拥有良好的化妆品功效，且丰富的植物提取物种类为化妆配方设计带来了更多选择性。因此，植物提取物应用在化妆品当中，既满足了消费者对于纯天然的追求[3]，又满足了化妆品厂商对功效多样性的追求。中药作为中华文明流传下来的瑰宝，除了有药用价值外，还有保健作用，可以作为保健品食用，因此中草药化妆品也成为化妆品的行业风口之一，其中中草药提取物更是提供了许多化妆品原材料。

余甘子（Phyllanthus emblica L.） 是一种分布在我国南方的特色经济树种[4]，是第一批列入“既是食物又是药物的物品名单” 的中药材，同时也是联合国卫生组织指定的世界推广种植的3 种保健植物之一。作为药材其已经拥有2000 余年的历史，在中药、藏药、蒙药、白药、壮药中都有广泛应用。余甘子含有上百种成分，主要包括多酚（ 单宁）、黄酮、还原糖、多糖、萜类，甾醇、挥发油以及多种营养成分[5，6]，其维生素C 含量极高[7]，能够提高人体免疫力，延缓衰老。余甘子已经在化妆品市场获得了长时间的关注，有一定的群众认同基础。因此，以余甘子为基础原料制成的余甘子提取物，在化妆品领域有极高的关注价值，需要用合适的方法进行来评价余甘子提取物的实际功效效果。斑马鱼与人体基因相似度高达87％ [8]，因此基因表达也拥有相似性，从而对斑马鱼进行试验的结果多数也适用于人体。而且相比于其他哺乳类实验动物，斑马鱼不存在周期长、繁殖慢、费用高且操作复杂等问题，可以快速大批量检测，且测试成本更低，在化妆品原料筛选和配方验证方面都已经得到了广泛的应用[9]。本文通过斑马鱼化妆品体外功效检测方式，对广州栋方生物科技股份有限公司的余甘子提取物在化妆品中的功效进行了探究。

01 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

余甘子提取物，广州栋方生物科技股份有限公司；氯化钠，广州化学试剂厂 ；十二烷基硫酸钠，麦克林上海生物化学有限公司；甲基纤维素，麦克林上海生物化学有限公司；斑马鱼引物试剂盒，合肥知恩生物技术有限公司。

1.1.2 仪器

1-14K 型冷冻离心机，德国希格玛实验室离心机公司；Z-A-S5 斑马鱼养殖系统，上海海圣生物实验设备有限公司；BCE224-1CCN 型分析天平，赛多利斯公司；IN812C 型低温恒温保温箱，雅马拓科技贸易（ 上海） 有限公司；SZX12型体式荧光显微镜，舜宇光学科技（ 集团） 有限公司；gentier96 荧光定时定量pcr 仪，西安天隆科技有限公司。

1.1.3 试验动物

野生品系AB 型斑马鱼，以自然或成对交配方式繁殖。

1.1.4 术语

受精后天数：days post-fertilization（dpf）受精后小时数：Hours post-fertilization（hpf）无可观察效应浓度：与对照组相比，对实验生物未产生显著性效应的最高受试物浓度，即“no observedeffect concentration（NOEC）”，不同实验项目的同一样品NOEC 不同。

1.2. 方法

1.2.1 保湿功效试验方法

用氯化钠过饱和溶液处理72hpf 的斑马鱼，由于渗透压皮肤表面将会失水皱缩，尾部面积因皱缩而变小。通过对尾部面积的影响评价化妆品的补水保湿效果[10，11]。

将30 尾72hpf 斑马鱼随机平均分成三组，分别是空白对照组、模型对照组和样品处理组。其中空白对照组加入鱼胚胎培养液，模型对照组加入2％氯化钠溶液，样品处理组加入用2％氯化钠溶液配制的0.125％样品混合液。

随后将斑马鱼胚胎转移至96 孔细胞培养板中，1 尾/ 孔，每孔加入200μl 溶液，置于28.5℃ ±0.5 ℃恒温培养箱孵育30min。30min 后，将斑马鱼置于载玻片上使其平躺，体式显微镜下拍照。用Image J 软件测量斑马鱼尾部面积，计算各组的平均斑马鱼尾部面积，通过对尾部面积的影响评价化妆品的补水保湿效果。

1.2.2 抗皱功效试验方法

皮肤的生长、修复、营养、弹性以及张力都与胶原蛋白有关，其流失会使皮肤光滑度下降，产生皱纹。在人体中，I 型胶原蛋白是一个三聚体，主要由两个α1 链和一个α2 链组成，分别由 col1a1 和 col1a2 基因编码，在结缔组织和骨中执行胶原蛋白相关生物功能。在斑马鱼中存在三种 I 型胶原基因，分别编码α1（I）、α2（I） 和α3（I） 链的 col1a1a、col1a1b 和 col1a2。因此，通过检测 col1a1a或（和）col1a1b 或（和）col1a2 基因相对表达量可表明样品是否具有抗皱功效[12]。

将60 尾96 hpf 的斑马鱼幼鱼随机分成两组，分别是空白对照组与样品处理组，每组挑选发育正常的96hpf 野生型斑马鱼幼鱼30 尾于6 孔板的1 孔中，在不伤害斑马鱼的情况下除去6 孔板中的缓冲水，并加入0.125％的余甘子提取物溶液3 mL，空白对照组加入缓冲水，盖上培养板面。

在28.5℃ ±0.5 ℃的生化培养箱中避光孵育至120 hpf，在实验满足有效性的基础上，受试物和空白对照组/ 溶剂对照组对比，如col1a1a 或（和）col1a1b 或（和）col1a2 相对表达量显著增加（P <0.05），说明该受试物在该浓度下，能增加弹性蛋白col1a1a 或（和）col1a1b 或（和）col1a2 相对表达量，可作为抗皱功效评价的证据支撑之一。

1.2.3 美白功效试验方法

黑色素的形成、转移、沉积和代谢是决定皮肤颜色的关键因素。斑马鱼的皮肤结构、黑色素合成机制与人类高度相似。

此外，斑马鱼胚胎透明，体表黑色素明显，易于观察及呈现；胚胎发育迅速，黑色素在3 ～ 4d 内迅速形成，試验周期短。本试验拟使用经皮吸收的方式进行给样，通过对比斑马鱼体表黑色素含量，判定产品（ 原料） 的美白功效[13-15]。

收集AB 系野生型斑马鱼24hpf 胚胎，分为2 组，分别是空白对照组和样品处理组，并随机分配到24 孔板中，每孔10 尾，每组设置3 个复孔。在不伤害幼鱼的情况下除去24 孔板中的缓冲水，然后迅速向每孔中加入1mL 溶液，其中空白组加入鱼胚胎培养液，样品处理组加入0.125％余甘子提取物。置于 28.5℃ ±0.5 ℃生化培养箱孵育48h 后，从斑马鱼胚胎中每孔随机选取至少5 尾斑马鱼，用4% 甲基纤维素固定，在显微镜下观察并拍照，拍照时选取斑马鱼俯视图，身体保持水平，头朝左侧。所有斑马鱼的拍照结果需在相同的仪器和环境下完成，且斑马鱼的体位应保持一致。

拍照完成后，选取黑色素累积部位通过Image J 软件进行黑色素面积统计，对数据进行分析。

1.2.4 温和无刺激功效试验方法

斑马鱼胚胎有极强的敏感性，可以通过经皮吸收方式，对包括药物、食品、化妆品等化合物的刺激性进行评价。在17～26 hpf 时期，斑马鱼胚胎运动神经已发育，但尚未有自主运动产生，此时的翻滚运动由外界刺激而产生，对此阶段斑马鱼胚胎的翻滚次数进行统计，可反映外源化合物对斑马鱼胚胎的刺激程度。本试验拟使用经皮吸收的方式进行给样，添加待测样品，观察斑马鱼胚胎的自主翻滚次数，具有温和无刺激功效的化妆品，自主翻滚次数与空白组胚胎翻滚次数没有显著差别，以此评价待测样品的温和无刺激功效[16]。将30 尾24hpf 的斑马鱼随机平均分成2 组，每组三孔，每孔5 尾，在不伤害幼鱼的情况下除去96 孔板中的缓冲水，然后迅速向孔中加入200μL 0.0625％样品溶液，空白组加入等量鱼胚胎培养液，孵育15min。孵育结束后，进行视频录制，每孔录制30s。视频录制结束后，对胚胎翻滚次数进行统计和分析。

1.2.5 数据处理

以上功效评价结果全部使用SPSS软件进行统计学分析，数据采用独立样本t 检验，P ＜ 0.05 表示具有显著性差异。

02 结果和讨论

2.1 保湿功效结果

如图1 所示，模型对照组相比空白对照组尾部面积显著性减小（P <0.05）。意味着保湿模型造模成功，样品处理组相比空白对照组没有显著性差异（P ＞ 0. 05），因为人体细胞与斑马鱼细胞都会在高渗溶液溶液中失水褶皱，所以可以使用过饱和氯化钠溶液处理斑马鱼尾部，使尾部失水褶皱面积减小，以此验证余甘子提取物的保湿功效。试验结果说明余甘子提取物有保湿功效。

2.2 抗皱功效结果

如图2 所示，样品处理组对比空白对照组col1a1a 基因相对表达量显著增加（P <0.05）。人体皮肤中胶原蛋白的含量是决定皮肤弹性高低的关键，如果皮肤中胶原蛋白流失，会使皮肤光滑度下降，产生褶皱。因此通过检测斑马鱼体内的胶原蛋白含量可以验证余甘子提取物的抗皱功效。试验结果说明余甘子提取物拥有抗皱功效。

2.3 美白功效结果

如图3 所示，空白对照组拥有较高的黑色素含量，而使用余甘子处理的样品处理组黑色素含量显著减少（P <0. 05），黑色素抑制率高达26％。人体的色斑中色沉与黑色素有关，由于斑马鱼皮肤与人体皮肤结构相似，黑色素形成机理也与人体相似，且斑马鱼幼鱼身体透明，便于观察表皮的黑色素细胞，因此通过检测斑马鱼体内的黑色素强度可以验证余甘子提取物的美白功效，试验结果说明余甘子提取物拥有美白功效。

2.4 温和无刺激功效结果

如图4 所示，样品处理组与空白对照组相比斑马鱼翻滚次数没有显著性增加（P ＞ 0.05），因为斑马鱼与人体基因高度相似，斑马鱼在17～26hpf 时期运动神经已经发育，但是却没有自主运动产生，只有外源化合物的刺激会导致斑马鱼的抽搐，因此统计斑马鱼抽搐次数可以验证余甘子提取物的温和无刺激功效。试验结果说明余甘子提取物拥有温和无刺激功效。

03 结论

综上所述，余甘子提取物在0.0625％浓度下具有温和无刺激和美白功效，在0.125％浓度下具有保湿与抗皱功效。其机理可能是余甘子含有上百种成分，主要包括多酚（ 单宁）、黄酮、还原糖、多糖、萜类、甾醇、挥发油以及多种营养成分，维生素C 含量极高。推测其拥有的美白、抗皱、保湿功效是因为成分有含量极高的维生素C、多糖和多酚，查阅资料可得维生素C、多糖和多酚拥有美白、抗皱、保湿等功效[17-19]。另外，查阅资料可得余甘子提取物拥有温和无刺激功效是因为其纯天然，不含人工化学成分，且拥有多种营养成分，部分人工化学成分有刺激性，而多种营养成分却可以滋养皮肤[20，21]。

余甘子在我国具有丰富的资源，原料易得，且拥有广泛的药用和食用价值，许多消费者对余甘子具有一定信任度。另外，余甘子的价格亲民，相比其他稀有的植物提取物更受大众的欢迎。因此，作为一款拥有美白、抗皱、温和无刺激、保湿功效的植物提取物，余甘子提取物拥有巨大的应用价值。