千日菊提取物的护肤功效研究

张泽华 陈晨 严明强

千日菊作为一种分布广泛的植物，在食品、医药等领域有诸多应用研究，目前很少在护肤品的功效测试中研究。本文采用高效液相色谱法测定了千日菊提取物（Acmella Oleracea Extract，AOE）的部分主要成分，用神经肌肉共植体模型测试AOE 對肌肉收缩的抑制作用。用神经肌肉共植体上重构皮肤模型测试AOE 对肌肉收缩的抑制作用。进而设计志愿者人体测试，测试AOE 对于人体皮肤的即时和长效抗皱效果，结果表明，AOE 可以减少皮肤皱纹。用免疫荧光法测试AOE 对TRPV1 的抑制作用，结果表明，1%AOE 即对TRPV1有很好的抑制作用。

关键词：千日菊；千日菊酰胺；神经肌肉共植体；志愿者测试；抗皱 TRPV1；舒缓

随着护肤品行业的持续发展，植物提取物凭借绿色背景，已然受到消费者热爱[1，2] 。

但市场对植物提取物护肤功效的担忧，主要在于很少有植物提取物产品能明确界定其功效成分，而来源于经验的功效讨论又缺乏系统的理论支撑及实际验证。如果植物提取物既有明确的主要功效成分，又有经验证的护肤功效，无疑将具有巨大的应用潜力！

千日菊（Acmella oleracea L./ Spilanthes acmellaLinn[3]） 是一种传统食材，有强烈的辛辣气味，有提神的作用，还有抗炎、抑菌、退热、抗氧化、减肥[4] 等作用。但目前还少有公开的文献报道千日菊提取物在护肤品中的综合护肤功效。

千日菊中含有氨基酸、三萜、豆甾醇、蜂蜡醇和生物碱，特别是富含N - 烷基酰胺[5]。Shama 等人指出由于烷基酰胺的存在，使得千日菊具有抗炎、抑菌、抗氧化、收敛的作用，并指出烷基酰胺的存在使该植物可用于食品和化妆品[6]。Huang 等的文献指出，千日菊中的Spilantho（l 千日菊酰胺）具有抗炎、抑菌、镇痛的作用[7]。

Monroe 等的文章指出，千日菊的花、叶、茎提取物中含有Spilanthol[8]。 Boonen 等的文章指出千日菊提取物中最多的酰胺是Spilanthol[9] （ 千日菊酰胺）。文献[10，11] 指出，千日菊含多种烷基酰胺，其中最重要的是千日菊酰胺，具有镇痛功效。因此，本文验证千日菊提取物中的主要功效成分——千日菊酰胺（Spilanthol），并测试千日菊提取物在神经肌肉共植体、神经肌肉共植体上重构皮肤、人体皮肤测试中的抗皱功效。

TRPV1 为辣椒素受体，激活后会导致钙离子内流，进而诱发神经反应，出现灼烧等感觉，因此抑制TRPV1 表达可以起到舒缓的作用。

设计体外测试试验，测试千日菊提取物对TRPV1 的抑制作用，从而测试其舒缓功效。

01 实验部分

1.1 试剂与仪器

千日菊提取物[ 溶剂为1，3- 丙二醇、水，原料来自法国嘉法狮（GATTEFOSSE）].千日菊提取物中文INCI： 千日菊[（ACMELLA OLERACEA）提取物]。

高效液相色谱（HPLC） 仪（Waters E2695）。

微型神经肌肉共植体24 孔板（Expertise Technologies）。

重构皮肤BETskin DE（Expertise Technologies）。

FOITS（人体皮肤快速光学造影测量设备） 系统，辨识度10μm。

3D 表皮皮肤模型（EpiKutis?）（ 博溪生物），EpiGrowth培养液（博溪生物）、PBS（博士德）、TRPV1 抗体（Abcam）。

1.2 实验方法

1.2.1 千日菊活性成分测定

高效液相色谱仪分析千日菊酰胺含量。采用RP18 反相分离柱，柱温40℃；紫外吸收检测器，检测器检测波长240nm；流动相采用乙腈/ 水（50/50），测试时检测样品用流动相1/3 稀释，进样量10μL。

1.2.2 千日菊提取物在神经肌肉共植体的功效测试

采用运动神经和横纹肌共植体。用E x p e r t i s eTechnologies公司制备的培养成熟的微型神经肌肉共植体24孔板。

神经肌肉收缩频率的观测：用连接摄像机的显微镜观察并对肌肉收缩频率计数（每次测量为30s 内计数）。

观察肌肉收缩的过程中，每次观测至少选择孔板上3个同类位点，当有2 个位点测试显示同向结果，则认为测试效果可采信。测试模型用卡利普多作为正向标的，二甲亚砜为负向标的，验证显示此方法所得结果为有效结果。

分别用0.6% 和1.2% 的千日菊提取物，作用于神经肌肉共植体培养基，测试不同时间条件下的神经肌肉的收缩频率。于测试前24h 计量神经肌肉收缩频率，测试前再次计量神经肌肉收缩频率，将千日菊提取物注入培养基，于5min/1h/4h 观测肌肉收缩频率。观测到完全的肌肉收缩抑制后，对培养基进行清洗，清洗后于1h/4h/24h 观测肌肉收缩频率。

1.2.3 千日菊提取物在神经肌肉共植体重构皮肤模型的功效测试

采用Expertise Technologies 公司制备的重构皮肤BETskin DE。

重构皮肤经过荧光剂皮肤渗透性测试，渗透性低于20%。测试中测试样品在重构皮肤表面涂敷，停留1h，然后移走重构皮肤，观测神经肌肉共植体的肌肉收缩频率（计量方法同1.2.2）。

分别以0.6% ，3.0% 的千日菊提取物用量进行测试。

同步设置安慰剂参照对比组。

1.2.4 千日菊提取物护肤品的志愿者实体功效测试

志愿者经过严格筛选，选取20 名志愿者，女性，年龄分布为38～50 岁，健康皮肤，有中到深度鱼尾纹。排除孕期、备孕人员，排除超敏性、过敏性皮肤人员，排除糖尿病、哮喘患者。用含有千日菊提取物2% 的膏霜和平行安慰剂膏霜进行单盲测试。受测者对2% 千日菊提取物的膏霜以及安慰剂进行半脸对照，即某志愿者左右脸各用哪款产品随机确认。使用方法：每日两次（早晚各一次），连续使用28天，期间用光栅投影分析仪测试D0、D1、D10、D20、D28的眼角鱼尾纹情况。

用光栅投影分析仪所得数据分析皮肤粗糙度，数据测量中采用二次平均法取得有效统计数值。数据正态分布用Shapiro-Wilk 测试验证（阈值1%）。正态分布通过的数据经t 检验验证显著性，正态分布未通过的采用WILCOXON检验验证显著性（活性物部分单尾检验/参照样双尾检验）。

1.2.5 测试千日菊提取物对TRPV1 的抑制作用

基于3D 表皮皮肤模型（EpiKutis?），测试千日菊提取物在1%、2%、5% 的浓度下，对TRPV1 蛋白的抑制作用。

以辣椒素CAP 刺激皮肤，设置空白组（无刺激），阴性对照组（有刺激），1，3 丙二醇组，阳性对照组（以反-4-叔丁基环己醇为阳性对照），测试组（1%，2%，5% 千日菊提取物用量），测试对TRPV1 蛋白的抑制作用。

按照测试条件以辣椒素和（或）测试样品（或阳性对照）涂布于皮肤模型表面，置于CO2 培养箱（37℃，5%CO2） 中孵育24h，然后用PBS 溶液清洗模型表面残留的受试物。而后用4% 的多聚甲醛进行固定处理，固定24h 后，将模型环切取下，进行辣椒素受体（TRPV1）的免疫荧光检测。重复3 次。

02 结果与讨论

2.1 千日菊活性成分含量测定

所得物为水/ 丙二醇/ 千日菊提取物的混合物，其中千日菊提取物含量大于5%（质量分数）。对此产品进行液相色谱分析，谱图如图所示。

液相色谱结果显示，千日菊提取物中含有Spilanthol千日菊酰胺。

千日菊酰胺分子式为：

2.2 千日菊提取物在神经肌肉共植体的功效结果

测量千日菊提取物作用于神经肌肉共植体模型，0.6%和1.2% 的千日菊提取物所得测试结果如图所示。

图2 结果表明，千日菊提取物0.6% 用量，能在1h 内将神经肌肉共植体的收缩频率从100%（未使用时的神经肌肉共植体肌肉收缩频率为100%） 降低到0，也就是肌肉收缩停止。在神经肌肉收缩停止后，迅速洗去施用的产品。可以观察到，神经肌肉的收缩开始缓慢恢复，至洗去后1h，神经肌肉的收缩恢复到接近初始未用产品时的收缩频率。

而使用1.2% 的千日菊提取物，在5min 内即可将神经肌肉共植体的收缩频率从100% 降低到0。而后迅速洗去施用产品，肌肉收缩仍显示为静止状态。测试开始4h，肌肉收缩开始缓慢恢复，至测试开始后24h，肌肉收缩恢复至接近初始未用产品时的频率。

以上结果表明，千日菊提取物具有减少肌肉收缩的效果。而效果的持续性则极大依赖于施用剂量。1.2% 千日菊提取物用量，其单次施用的抑制效果可达24h。

2.3 千日菊提取物在神经肌肉共植体重构皮肤作用的功效结果

分别以0.6% 、3.0% 的千日菊提取物用量进行测试。

同步设置安慰剂参照对比组，所得结果如图所示。

圖3 结果显示，0.6% 用量的千日菊提取物在施用后6h（此时已经移走神经肌肉共植体上的皮肤模型），肌肉收缩频率降到最低值，为初始收缩频率的28%。此后肌肉收缩开始缓慢恢复，至2h 恢复至接近初始收缩频率。

3.0% 用量的千日菊提取物也在施用后6h 后达到最低值，此时肌肉收缩频率为0，即肌肉收缩停止。此后肌肉收缩开始缓慢恢复，至24h 恢复至接近初始收缩频率的60%。

同步安慰剂则对肌肉收缩没有任何影响。

以上结果表明，在神经肌肉共植体重构皮肤上施用千日菊提取物，千日菊提取物的作用效果被大幅延缓。但同时被延缓的，还有肌肉收缩的恢复速度。

0.6% 含量的千日菊提取物，在6h 后将肌肉收缩频

率降至最低（初始收缩频率的28%），再经将近24h，恢复到施用千日菊提取物之前的肌肉收缩频率。比单纯神经肌肉共植体的作用速率延后5h。而3% 的千日菊提取物，使得24h 后肌肉收缩频率只恢复到了未施用时的60%。

以上结果说明，重构皮肤的存在，减缓了千日菊提取物的作用速度，同时也延长了千日菊提取物的效果持续的时间。

以上测试结果，说明千日菊提取物可以减少神经肌肉共植体重构皮肤的肌肉收缩，且具有很强的剂量依赖性。

千日菊提取物用量达到一定程度（如3% 以上） 后，神经肌肉共植体上重构皮肤所做的肌肉收缩测试，肌肉收缩在24h 后不会完全恢复。

2.4 千日菊提取物护肤品的志愿者实体功效测试

以15 名志愿者的测试数据进行分析。

对鱼尾纹位置的皮肤粗糙度进行分析，所得结果如图所示。

以上结果表明，在28d 的时间长度内，含千日菊提取物的膏霜对眼角皱纹造成的总体粗糙程度有明显改善，皱纹总体减少14.2%。这也印证了千日菊提取物抗皱功效的长期持续性。且千日菊提取物在第一天即取得统计学显著的皱纹改善效果。

提取某志愿者眼角鱼尾纹图片如图所示。

从以上结果可以看出，志愿者眼角部的鱼尾纹情况有明显视觉可见的改善。

2.5 千日菊提取物对TRPV1 的抑制作用

对空白对照组BC， 阴性对照组（刺激）NC，1，3 丙二醇组（3. 5%），阳性对照组[ 刺激及15.6μg /mL 反-4- 叔丁基环己醇（舒缓辣椒素刺激）]PC，1% 千日菊提取物，2%千日菊提取物，5% 千日菊提取物进行测试。

进行辣椒素受体（TRPV1） 的免疫荧光检测，显微镜下拍照，采集图片并分析。选取目标蛋白TRPV1 染色颜色，用GraphPad Prism 软件分析，分析荧光染色的TRPV1表达情况（绿色荧光），得到其相对IOD 平均值。用t-test方法分析结果相对NC 组的显著性。

所得结果如图6 所示。

结果显示，1%、2%、5% 的千日菊提取物，相对阴性对照NC 组，都有很好的抑制TRPV1 的作用，其中1% 千日菊提取物对TRPV1 的表达抑制率达到61%。且相对NC组，测试结果t 检验，数据结果显著。

结果表明， 排除成分中1，3 丙二醇的影响，千日菊提取物对TRPV1 的表达有显著的抑制作用，且1% 千日菊提取物对TRPV1 的表达抑制作用已经优于PC 组。

03 结论

（1） 验证千日菊提取物含有酰胺成分——千日菊酰胺（Spilanthol）。

（2） 神经肌肉共植体/ 神经肌肉共植体重构皮肤的肌肉收缩频率测试说明：千日菊提取物可以减少肌肉收缩。

在神经肌肉共植体重构皮肤模型中，肌肉收缩频率未达到100% 恢复，提示长期使用千日菊提取物将产生累积的减少肌肉收缩功效。

（3） 人体测试的即时测试结果和长期（28d） 结果表明，2% 千日菊提取物可以显著减少皮肤的皱纹，降低皮肤粗糙度。且千日菊提取物减少皱纹的功效，具有即时性和长效性，可用于即时抗皱和长效抗皱护肤品。千日菊提取物2% 即可有良好的长效抗皱效果。

（4）1% 千日菊提取物即可对TRPV1 有显著抑制作用，因此在皮肤舒缓方面可以有所应用。

综上所述，千日菊提取物是一款良好的即时和长效抗皱活性物，且有一定舒缓功效。