地方晒烟琼中五指山-1的青枯病抗性鉴定与指纹图谱开发

王亚男　耿锐梅　李世斌　肖志亮　刘正文　贾振国　杨爱国　任民

摘要：鑒定抗烟草青枯病的优异种质资源，拓宽青枯病抗性品种的遗传背景，提高品种抗病水平，是当前烟草抗性育种的研究重点。以 Dixie Bright 101、K326、红花大金元为对照品种，在室内接种 FJ-SMNT、FQY-4、Y45等3株菌株，对地方晒烟种质资源琼中五指山-1进行病情指数调查与抗性评价，并基于种质资源重测序数据，开发了琼中五指山-1的特异性 SNP 指纹图谱。结果表明，琼中五指山-1发病缓慢，病情轻微，病情指数增长平缓，对3株菌株均有良好的抗性，抗性水平显著高于抗病对照。构建的特异性指纹图谱由339个 SNP 位点组成，基于云计算平台开发了该指纹图谱的检测程序并利用测序技术对指纹图谱的可靠性进行了验证，证明了该指纹图谱可以从随机取样的样品中准确鉴定出琼中五指山-1。琼中五指山-1是目前国内发现的青枯病抗性最好的种质资源之一。

关键词：青枯病；晒烟；种质资源；抗性鉴定；指纹图谱

中图分类号： S572.03         文献标识码： A         文章编号：1007-5119（2023）03-0077-08

Identification of Bacterial Wilt Resistance and Fingerprint Development of Sun-cured Tobacco Qiongzhongwuzhishan-1

WANG Yanan， GENG Ruimei， LI Shibin， XIAO Zhiliang， LIU Zhengwen， JIA Zhenguo， YANGAiguo， REN Min*

（Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： The identification of excellent resistance germplasm resources to bacterial wilt， broadening the genetic background and improving the disease resistance level of tobacco varieties are the research focuses of current tobacco resistance breeding. In this study， Dixie Bright 101， K326， and Honghuadajinyuan were used as control varieties， and three Ralstonia solanacearum strains FJ-SMNT， FQY-4， and Y45 were used to inoculate tobacco plants. We then recorded the disease index and evaluated the bacteria wilt resistance of Qiongzhongwuzhishan-1， a local sun-cured tobacco germplasm resource. And based on the resequencing data of germplasm resources， the characteristic SNP fingerprint of Qiongzhongwuzhishan-1 were developed. The results showed that Qiongzhongwuzhishan-1 had a slow onset， mild disease occurence， and a mild increase in the disease index， with good resistance to all three strains. The level of resistance was significantly higher than that of the resistant control. The specific fingerprint consisted of 339 SNP loci， and a detection program for this fingerprint was developed based on the cloud computing platform. The reliability of this fingerprint was verified using sequencing technologies， and it was demonstrated that this fingerprint could accurately identify Qiongzhongwuzhishan-1 from randomly sampled specimens. The results from this study indicated that Qiongzhongwuzhishan-1 is one of the germplasm resources with the best resistance to tobacco bacteria wilt found in China.

Keywords： bacterial wilt; sun-cured tobacco; germplasm resources; resistance identification; fingerprint

青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传细菌性病害，是热带、亚热带地区常见的毁灭性植物病害[1]。青枯菌寄主范围十分广泛，能够侵染50多个科450多种植物[2]，其中茄科的重要经济作物烟草[3]、马铃薯[4]、番茄[5]、茄子[6]等均能被青枯菌侵染。烟草青枯病对世界各地的烟叶生产均有严重影响[7]。在我国，烟草青枯病主要发生在南方烟区，包括广东、广西、福建、湖南、四川、贵州、安徽等省份。近年来，国内烟草青枯病有从南方地区向北方地区蔓延的趋势[8]。

种植抗病品种是防治烟草青枯病的一条经济有效途径，培育抗病品种也是烟草育种的一项重要工作。上世纪30年代，美国率先开展了烟草青枯病抗性育种研究，筛选到高抗水平的烟草种质资源 TI 448A[9]。上世纪90年代至本世纪初，CORESTA （Cooperation Centre for Scientific Research Relativeto Tobacco，国际烟草科研合作中心）对多个国家代表性抗源的多年多点抗性鉴定表明，TI 448A 具有稳定的抗性。并且由于 TI 448A 烤后烟叶质量和香气类似烤烟，因此逐渐成为了世界烟草青枯病抗性育种的主要抗源。且以 TI 448A 为亲本育成的 Dixie Bright 101及其衍生品种 NC95和 Coker139等品种又成为后续一系列抗性品种的主体亲本，世界各国陆续用这些品种为抗源选育了新的青枯病抗性品种[10]。我国利用的主要抗源其抗性也均来自 TI 448A，育成了岩烟97、安烟2号等抗病品种，但在生产上推广应用面积较小，抗性达不到亲源水平[11]。可见，目前所有育成品种的抗性几乎都来自 TI 448A[12]，

导致现有抗病品种的抗源单一、遗传背景狭窄问题特别突出，且现有品种的抗性水平距离生产需要仍有较大差距，不能很好地起到防控青枯病的作用[13-14]。与此同时，烟草种质资源的青枯病抗性鉴定仍不充分，高达61%的烟草种质资源无青枯病抗性鉴定记录，现有的鉴定记录还存在时间跨度大（从建国到至今）、鉴定标准不统一、鉴定方法不精准等问题。

构建分子指纹图谱对保护和利用优异种质资源意义重大。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms ，SNP）作为第三代分子标记，与新一代测序技术（Next-generation Sequencing ，NGS）相结合[15]，具备低成本、高效率、高准确性等优点[16]，在水稻[17]、玉米[18]、小麦[19]等主要农作物品种的指纹图谱开发中得到日益广泛的应用。

为此，本研究拟利用青枯病苗期室内人工接种抗性鉴定技术[20]，对前期发现的田间抗性良好的地方晒烟种质资源琼中五指山-1，利用多个青枯菌序列变种进行更加精细的抗性鉴定。以期进一步明确该种质的青枯病抗性水平，并基于测序技术开发琼中五指山-1的特异性 SNP 指纹图谱。为应用该种质资源进行青枯病抗病育种提供可靠的抗性鉴定依据，并为该种质资源的有效保护提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试烟草品种地方抗青枯病晒烟种质琼中五指山-1，抗性对照品种 Dixie Bright 101（烤烟引进品种），中抗对照品种 K326（烤烟引进品种），感病对照品种红花大金元（烤烟育成品种）。指纹图谱验证种质为 ZX145（雪茄烟种质资源）、海南7 号（晒烟地方种质资源）、中烟300（烤烟育成品种）和红花大金元。由国家烟草种质资源中期库（青岛）提供。青枯病高抗种质资源 GDSY-1[21]由广东省农业科学院作物研究所提供。

1.1.2 供试青枯菌菌株利用3株青枯菌菌株开展供试材料的抗性鉴定，分别为福建菌株 FJ-SMNT （序列变种34）、贵州菌株 FQY-4（序列变种17）、云南菌株 Y45（序列变种54），均属1号生理小种、演化 I 型、生化变种 III 型。

1.2 青枯病抗性鉴定

1.2.1 菌株活化与人工接种将用于接种的菌株解冻后，于 TTC 固体培养基（不含抗生素）平板上划线，倒置于28℃恒温培养箱中培养36～48 h；挑选单菌落于NB 液体培养基（不含抗生素）中，28℃、220 r/min 摇床中培养24～48 h。将培养好的菌悬液配制成约 OD600=0.05（约5.0×107 cfu/mL）菌悬液。烟苗培养至4叶 1心期时，采用灌根法人工接种10 mL 菌悬液。每个处理重复2次，每个重复6株烟苗。接菌后的烟苗置于人工气候室内培养，温度（30±2）℃、相对湿度75%、光照12 h/d。

1.2.2 病情指数调查接种后每隔3～4 d 调查供试材料发病情况并计算病情指数。供试材料的发病等级参考孙希芳[22]方法、抗性评价参考国家标准 GB/T 23222—2008[23]。

按照公式（1）计算病情指数（Disease Index， DI）。

病情指数（DI）=查总株数（发病株数）最高级代表值（该病级代表值）×100  （1）

1.3 指纹图谱构建

种质资源的 GBS（Genotyping-by-Sequencing）重测序由国家烟草种质资源中期库（青岛）提供，从中挑选了5196份烟草种质资源的群体 SNP 分型数据。按照以下条件过滤 SNP 位点：（1）二态性 SNP 位点，（2）SNP 位于组装后的染色体区域，（3）种质资源群体的平均测序深度dp≥10，（4）种质资源群体中琼中五指山-1的测序深度dp≥10，（5）位点的质量值 QUAL≥3000，（6）缺失率 miss≤0.3，（7）群体杂合率 his≤0.1；然后，利用vcftools软件的--freq命令计算入选位点的等位变异频率，并筛选稀有等位变异（minor allele）频率Maf≤0.2的位点；最后，利用 Python（V 3.8.10）计算机语言编寫的脚本程序（下载地址： http：//47.104.13.144：8686/down/HgiSCa8dQ0Jc.py ），从上述步骤获得的数据中，进一步筛选满足以下条件的 SNP 位点：（1）琼中五指山-1在该位点是纯合基因型，（2）琼中五指山-1的等位变异属于稀有等位变异。利用以上步骤获得的 SNP 位点组成琼中五指山-1的特异性指纹图谱。指纹图谱位点的染色体分布图采用 MG2C 软件[24]绘制。

1.4 指纹图谱分析程序的开发

利用 Python（V3.8.10）计算机语言，Django Web 框架（V4.0.3），基于阿里云技术开发了琼中五指山-1种质资源特异性 SNP 指纹图谱检测程序，访问地址为 http：//47.104.13.144/fingerprint/qzwzs/。用户界面如图1所示。按照 Worku 等[25]、Povysil等[26]的方法计算遗传距离。

1.5 指纹图谱的验证

于中国农业科学院烟草研究所青岛试验基地温室内，选取海南7号、红花大金元、 ZX145、中烟300和琼中五指山-1等5份材料的苗期叶片组织，随机编号后送北京诺禾致源科技股份有限公司，利用 Illumina HiSeq PE150测序平台进行双末端（Paired-End）150全基因组重测序（Whole Genome Sequencing ，WGS），测序深度为3X。从测序结果中，提取相应指纹图谱 SNP 位点的分型数据，利用琼中五指山-1种质资源特异性 SNP 指纹图谱检测程序进行分析，最后分析结果与实际品种进行核验，判定指纹图谱的可靠性。

2 结果

2.1 琼中五指山-1植物学性状

琼中五指山-1是原产地为海南省琼中黎族苗族自治县的地方晒烟种质资源。株型塔形（图2），叶形长椭圆，叶尖渐尖，叶面较平，叶缘波浪形，叶色绿，叶耳中，叶片主脉细，叶片较薄，茎叶角度中，花序松散、菱形，花色淡红，种子椭圆形、浅褐色，蒴果卵圆形，株高140.3 cm，茎围5.84 cm，节距6.91 cm，叶数14，叶长47.2 cm，叶宽18.1 cm，花冠长度5.03 cm ，花冠直径1.8 cm ，花萼长度1.17 cm ，千粒质量0.17 g，移栽至现蕾时间48 d，移栽至中心花开放时间57 d，全生育期148 d。

2.2 青枯病发病情况

从接种 FJ-SMNT 、FQY-4、Y45菌株后不同时间的供试材料病情指数可知（图3），接种后28 d 是调查抗性水平的关键时期。此时感病对照红花大金元的抗性评价达到感病至高感，病情指数分别为93.8、91.7、83.3；琼中五指山-1的抗性评价均为高抗，病情指数分别为12.5、2.1、18.8；抗病对照 Dixie Bright 101的抗性评价为中抗至高抗，病情指数分别为45.8、18.8、45.8。由此可见，琼中五指山-1对3株菌株均表现为高抗，抗性水平显著高于 Dixie Bright 101。不同菌株间，琼中五指山-1对 FQY-4菌株抗性最好，其次为 FJ-SMNT 和 Y45。

从发病时间看，琼中五指山-1的特点为发病晚，在抗病对照 Dixie Bright 101发病中期，即接种后17～21 d，琼中五指山-1才开始发病，且发病程度轻，多为1～2级，病情指数呈缓慢平稳增长。

2.3 SNP 指纹图谱构建

按照1.3中的步骤，共筛选到339个符合条件的 SNP 位点，标记编号、位置信息及分型详见链接 http：//47.104.13.144：8686/down/oPGGNMfAHFy4.do cx ，分布在参考基因组的24条染色体上（图4），指纹图谱 SNP 位点间的平均间距为23.2 Mb，在 Chr6染色体上的指纹图谱位点最多，为37个。SNP 的变异类型中， A/G 转换136个，C/T 转换118个，G/T 颠换25个，A/T 颠换25个，A/C 颠换27个， C/G 颠换8个，其中转换（ts）共计254个，颠换（tv）共计85个，转换颠换比（ts/tv）为2.99。参试琼中五指山-1群体指纹图谱 SNP 位点上的基因型均为稀有等位变异，等位变异频率从0.001到0.199，平均为0.092。

2.4  SNP 指纹图谱的可靠性验证

按照1.5中的方法步骤，对琼中五指山-1种质资源 SNP 特异性指纹图谱的可靠性基于测序技术进行了实际验证。对海南7号、红花大金元、ZX145、中烟300和琼中五指山-1等5份供试材料随机编号后，进行3X 覆盖度的全基因组重测序。从测序数据中提取各供试材料在339个指纹图谱位点上的实际测序分型结果。将数据输入“琼中五指山-1种质资源特异性 SNP 指纹图谱检测程序”，计算上述5份材料与数据库中各种质资源的遗传距离，相关计算结果详见表1，然后找到与种质资源数据库中琼中五指山-1最近的供试材料编号，并将编号对应回样品的品种名称。由于 WGS 测序技术的随机性，3X 覆盖度无法完全涵盖供试材料的基因组全长，故339个指纹图谱位点，在5个样品中实际检测到的位点数量为231～274。实际分析结果表明，利用本研究开发的特异性 SNP 指纹图谱，能够有效区分琼中五指山-1样品与其他4份供试材料，并且与数据库中的琼中五指山-1遗传距离最近。

3 讨论

烟草青枯病抗性优异种质资源是抗病品种培育的关键材料，决定着青枯病抗性育种的成效和水平。相比田间病圃自然发病抗性鉴定，室内苗期人工接种抗性鉴定具有周期短、环境可控、菌株类型明确、效率高等优势，非常适合种质资源的青枯病抗性精准鉴定[27]。利用人工接种抗性鉴定可以比较种质资源对不同菌株的抗性反应差异，对全面分析种质资源实际抗性表现和适宜生态区具有重要帮助[28]。本研究对烟草地方晒烟种质资源琼中五指山-1，在气候室内进行了苗期人工接种抗性鉴定，结果表明，琼中五指山-1对3株菌株均有良好的抗性，发病缓慢，病情轻微，病情等级增长平缓。本研究所選用的3株菌株广泛分布在我国主要烟区[29]，因此可预见琼中五指山-1能够在国内大部分烟区表现出良好抗性。与目前已知的烟草青枯病抗性种质资源 TI 448A[30]、GDSY-1[21]、反帝三号[31]、大叶密合[32]、岩烟97[33]等相比，琼中五指山-1与 GDSY-1的抗性表现相近，优于已报道的抗性品种或种质资源[34]，是目前青枯病抗性最好的烟草种质资源之一。

构建 DNA 指纹图谱是种质资源保护与鉴定的重要技术手段[35]。分子指纹图谱的检测技术不断发展[36]，呈现了从人工到全自动、从低通量高成本到高通量低成本的发展趋势。目前烟草栽培品种的测序技术已经十分成熟[37]，且测序成本也降到较为经济的水平，高通量测序在烟草上的应用更加深入、广泛，因此本研究选择利用测序技术作为检测指纹图谱位点分型的技术手段。高通量测序最常遇到的问题是由于测序的随机性而带来的位点缺失[38]。例如在本研究中，5个样品都未检测到全部339个位点，检测到位点的比例从68.1%到80.8%，但实际分析结果证明，该指纹图谱仍然能有效地进行种质资源鉴定。与基于相同 SNP 位点鉴别大批量种质[39] 的通用性指纹图谱相比，本研究开发的特异性指纹图谱，需要预先分析每个品种或种质的特异 SNP 位点，因此本研究开发特异性位点分析程序（材料与方法1.3）实现了批量化种质资源 SNP 数据处理，解决了特异性指纹图谱开发的效率问题。综上所述，基于测序技术的特异性 SNP 指纹图谱为烟草种质资源的保护与鉴定提供了高效、可靠、低成本的技术手段。

我国有丰富的晒晾烟种质资源，在国家烟草种质资源中期库保存的烟草种质资源中，晒晾烟是数量最丰富的种质类型[40]。琼中五指山-1作为地方晒烟种质资源，不适合直接用于生产，但作为优异青枯病抗病种质资源，在青枯病抗性品种培育和抗病基因发掘方面应用前景广阔。琼中五指山-1的抗性水平优异，且与烤烟主栽品种间遗传差异更加丰富，因此十分适合作为遗传定位群体的抗病亲本。以琼中五指山-1为供体亲本，开展抗病性状向主栽品种的定向转移，有希望系列化培育青枯病抗性改良品种。综上所述，本研究鉴定发现的优异种质资源琼中五指山-1及其特异性 SNP 指紋图谱，为该种质在青枯病抗性育种中的有效应用奠定了坚实基础。

4 结论

青枯病人工接种抗性鉴定结果表明，地方晒烟种质资源琼中五指山-1对我国常见青枯菌序列变种的抗性水平为高抗，是目前我国发现的抗性最好的种质资源之一。构建了由339个 SNP 位点组成的琼中五指山-1品种特异性指纹图谱，实际验证结果表明，该指纹图谱简便、高效、可靠性好，可用于琼中五指山-1的种质资源鉴定。

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