超声波辅助醇提法提取银杏叶中多种活性成分

李济甫,冯扬帆,孟珂渏,王沈燕,刘 鑫,马 燕,杨 洁,2*

(1.武汉东湖学院护理与健康管理学院(生命科学与化学学院),湖北 武汉 430212;2.武汉东湖学院生物医用材料创新研究所,湖北 武汉 430212)

银杏是我国的特有药用植物,其根、茎、叶、花、果实、树皮均可入药,尤其是银杏叶,易于采摘,又具有极高药用价值,常作为主要入药采集部位。银杏叶中含有多种生物活性成分,如黄酮类、萜内酯类、多糖类、有机酸、有机醇等[1]。我国每年作为植物药原料使用的银杏叶达数万吨,大部分用于生产口服制剂用银杏叶提取物,这些未做单一成分分离的银杏叶提取物在应用中受到了很大限制,多种活性成分由于含量低或其它成分的影响而未发挥应有的药理作用。近年来,研究人员为分离出高纯度的银杏叶活性成分进行了深入探索,成功分离得到高纯度的黄酮醇苷、萜内酯等活性成分[2],但多集中于单一活性成分。目前,具有抗禽流感病毒、抗菌、抗癌等药理学功能的莽草酸以及具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血作用的多糖已被初步分离与富集,且数量巨大[3-4],若能分阶段分离纯化,进行综合开发利用,可有效提升银杏产业的附加值,还可减少对环境的污染。

常用的银杏叶活性成分提取方法有有机溶剂提取法、水提法、水提-树脂法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶解提取法等[5-6],提取方法对各活性成分的产率和产品质量影响很大。作者采用超声波辅助醇提法综合提取银杏叶中多种活性成分,通过溶剂萃取法脱脂、去叶绿素,经DM130大孔树脂吸附脱附后,再对银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮分阶段逐一分离纯化,并对工艺条件进行优化,为银杏叶多种活性成分的综合开发利用奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

银杏叶,6年龄,采摘于武汉东湖学院校内。

DM130型大孔吸附树脂(弱极性),天津浩聚树脂科技有限公司;莽草酸标准品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;芦丁标准品,上海源叶生物科技有限公司;葡萄糖标准品,国药集团有限公司;其它试剂均为分析纯。

LC-16型高效液相色谱仪、AUY120型分析天平,日本岛津公司;721型紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;FW100型高速粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;KQ-100DE型超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶提取物的制备

将银杏叶洗净,烘干,粉碎,过60目筛,备用。称取10 g银杏叶粉,按料液比1∶5(g∶mL,下同)加入75%乙醇,40 ℃下200 W超声提取2 h;过滤,滤渣再超声提取2次;合并滤液,减压回收乙醇,得棕色银杏叶提取物。

1.2.2 银杏叶提取物的脱脂处理

将银杏叶提取物加水溶解,用1/3倍体积的石油醚萃取2～3次以脱脂、去叶绿素,取下层分液进行分离纯化。

1.2.3 银杏叶提取物的分离纯化

将分液浓缩后加至大孔吸附树脂柱上,控制流速为1 BV·h-1,使完全吸附;然后用2～3 BV纯水洗脱,洗脱速度为2 BV·h-1;再用2～3 BV的75%乙醇洗脱;洗脱液浓缩至原体积一半,用稀盐酸调节pH值为3.2,加入2倍体积75%乙醇沉淀;6 000 r·min-1离心10 min,分出沉淀,上清液再醇沉2次;合并沉淀,得银杏多糖粗提物;按料液比1∶5(g∶mL)加入0.2%H2O2溶液,进行脱色处理;依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤各2次,减压浓缩,低温干燥,得银杏多糖成品。

将银杏叶提取物洗脱液醇沉3次后的上清液减压浓缩除醇后,加入2倍体积的石油醚,搅拌4 h,倒入分液漏斗静置分液;将上层液浓缩至原体积一半后再用2倍体积石油醚沉淀2次;合并沉淀,得银杏莽草酸粗提物;加入少量石油醚,搅拌,分出莽草酸固液混合相,过滤,洗涤,低温干燥,得银杏莽草酸成品。

将银杏叶提取物洗脱液减压浓缩除醇后,用饱和Ca(OH)2溶液调节pH值为8,4 ℃下静置,过滤去除碱性不溶物;用6 mol·L-1盐酸调节pH值为3～4,4 ℃下静置,过滤去除酸性不溶物;滤液浓缩干燥,得银杏黄酮成品。

2 结果与讨论

2.1 综合提取工艺优化

2.1.1 乙醇体积分数对各活性成分产率的影响(图1)

图1 乙醇体积分数对银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮产率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on yields of ginkgo polysaccharides,ginkgo shikimic acid,and ginkgo flavonoids

由图1可知,当乙醇体积分数从45%增至75%时,银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮的产率均增幅明显;当乙醇体积分数超过75%后,产率均趋于稳定。这是因为,银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮都易溶于醇水溶液,随着乙醇体积分数的增加,提取量增加,产率相应升高[7];在提取达到平衡后,继续增加乙醇体积分数,会增加分离负荷,浪费试剂,增加生产成本。因此,确定最佳乙醇体积分数为75%。

2.1.2 超声时间对各活性成分产率的影响(图2)

由图2可知,随着超声时间的延长,银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮的产率均逐渐升高而后略微降低;在超声时间为2.0 h时,三者产率均达到最高。可能是因为,超声时间过长,溶出物在持续高频率超声波的作用下会部分降解而失去生物活性,导致产率略微降低[7]。综合考虑,确定最佳超声时间为2.0 h。

2.1.3 脱脂溶剂对各活性成分产率的影响

未脱脂的银杏叶粗提物含有大量的脂类、叶绿素等物质,给活性成分的分离纯化带来困难,不仅耗时而且成本高[8]。在分离纯化前脱脂,一方面可以缩短分离时间,减少提取溶剂的用量;另一方面,脱脂后更有利于分离,提高活性成分的产率,纯度也会得到很大提升。分别以石油醚、乙醚对银杏叶粗提物进行脱脂处理,考察脱脂溶剂对各活性成分产率的影响,结果见表1。

表1 脱脂溶剂对银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮产率的影响/%

由表1可知,以石油醚和乙醚为脱脂溶剂时,各活性成分产率明显高于未脱脂时的,其中石油醚的脱脂效果最佳。可能是因为,石油醚和乙醚都有脱脂作用,但是乙醚一般要与乙醇或甲醇等比例混合时脱脂效果才较好,又因各活性成分均易溶于乙醇,且乙醚沸点低,易挥发,故单纯乙醚的脱脂效果略差于石油醚。因此,确定最佳脱脂溶剂为石油醚。

2.2 分离纯化工艺优化

2.2.1 银杏多糖脱色剂的选择

常用的脱色方法有离子交换法、活性炭法和H2O2法,离子交换法脱色过程复杂,操作繁琐。本实验分别采用活性炭法和H2O2法对银杏多糖粗提物进行脱色,其脱色效果见表2。

表2 活性炭法和H2O2法的脱色效果比较

由表2可知,随着活性炭用量的增加,银杏多糖的脱色效果越来越好,但产率显著降低,可能是因为,活性炭疏松多孔,在吸附色素杂质的同时,银杏多糖(多为酸性多糖大分子极性化合物)易被活性炭吸附而导致产率降低;相较于活性炭脱色,H2O2的脱色效果较理想,但用量不能过多,否则易导致多糖降解,一般在0.4%以内较佳,且脱色过程中多糖几乎无损失,同时H2O2具有挥发性,脱色后容易除去。综合考虑,采用0.2%H2O2对银杏多糖进行脱色。

2.2.2 银杏莽草酸的分离纯化方法选择

莽草酸的分离多采用树脂吸附法和柱层析法。鉴于银杏叶提取物洗脱液在醇沉3次后已除去大部分杂质,本研究采用有机溶剂沉淀法分离纯化银杏莽草酸。考虑到莽草酸难溶于石油醚,在石油醚中可沉淀析出[9],又由于石油醚的密度小,与莽草酸形成的固液混合相产生分层,可以采用分液漏斗分离;再将含有莽草酸沉淀的固液混合相过滤,洗涤,得到高纯度莽草酸。该法大大降低了分离难度,经过两次沉淀分离,银杏莽草酸的纯度可达98%以上,与树脂吸附法的分离效果相当,而且方法更简便。因此,采用石油醚沉淀法对银杏莽草酸进行分离纯化。

2.2.3 银杏黄酮的分离纯化方法选择

银杏叶提取物洗脱液减压浓缩除醇后,可能还有少量多糖等黏性杂质。采用酸碱除杂法对银杏黄酮进行分离纯化,通过加入饱和Ca(OH)2溶液使碱性沉淀析出,再调节pH值至3～4除去酸性杂质,纯度最高可达35.72%。

2.3 综合提取与单独提取的比较

在优化的工艺条件下,采用超声波辅助醇提法综合提取银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮;另取相同量的银杏叶粉,在相同条件下采用超声波辅助醇提法分别提取银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮,提取结果见表3。

表3 综合提取与单独提取结果比较

由表3可知,在优化工艺条件下,采用超声波辅助醇提法综合提取银杏叶中多种活性成分,银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮的产率分别为4.67%、3.80%、0.77%;而采用超声波辅助醇提法分别提取银杏叶中银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮,其产率分别为4.88%、3.91%、0.83%。从产率来看,虽然每种活性成分的综合提取产率较单独提取的略低,但综合提取的总产率要远远高于任意单独提取的;从产品质量来看,综合提取和单独提取的活性成分的产品纯度相差不大,外观几乎无差别。与单独提取比较,综合提取的成本低、资源利用度高,具有更高的产业化价值。

3 结论

采用超声波辅助醇提法综合提取银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮,通过溶剂萃取法脱脂、去叶绿素,DM130大孔树脂吸附脱附,再逐一分离纯化,得到高纯度的银杏多糖、银杏莽草酸、银杏黄酮,其纯度分别为85.20%、98.25%、35.72%,产率分别为4.67%、3.80%、0.77%。该方法使银杏叶得到了最大化利用,为银杏叶的进一步开发利用提供了参考。