正交实验优化重楼皂苷Ⅰ的微波提取工艺

张雪娇,王 月,范 涛,成 昭

(西安医学院药学院,陕西 西安 710021)

重楼是一种传统中药材,通常以根茎入药,具有消肿止痛、凉肝定惊等功效,常用于治疗蛇虫咬伤、跌扑伤痛、疔疮痈肿等症。药理学研究发现,重楼的主要活性成分甾体皂苷具有抗菌消炎、镇痛止血及抗肿瘤等药理活性[1],其中重楼皂苷Ⅰ的抗肿瘤活性已成为研究热点。邓碧凡等[2]通过MTT法检测发现,重楼皂苷Ⅰ对低氧条件下的喉癌Hep-2细胞增殖具有明显的抑制作用;陈舒怡等[3]研究发现,重楼皂苷Ⅰ可通过线粒体破碎快速诱导肺癌NCI-H661细胞的凋亡;庞晓辉等[4]研究发现,结肠癌耐奥沙利铂细胞经重楼皂苷Ⅰ处理后,其Bax和Caspass-3蛋白表达水平有所升高,进而介导癌细胞及其耐药细胞的凋亡。

重楼皂苷Ⅰ的提取一般采用有机溶剂回流法,以乙醇为提取溶剂,易操作、成本低,但提取率较低[5-6]。童立雷等[7]利用纤维素酶对植物细胞壁的破碎作用,以70%乙醇为提取溶剂,采用超声辅助酶法提取重楼总皂苷,并通过响应面法优化提取工艺;刘江等[8]采用正交实验优化了南重楼中4种重楼皂苷的超声提取工艺,并对优化工艺进行了方法学考察。近年来,微波法越来越多地应用于中药活性成分的提取[9-10]。因此,作者采用微波法提取重楼皂苷Ⅰ,并通过正交实验优化提取工艺,为重楼药材的深入开发利用提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

重楼,采自陕西汉中镇巴山区,经西安医学院药学院生药教研室张彦副教授鉴定为百合科重楼属植物的干燥根茎。

重楼皂苷Ⅰ对照品(>98%),优级纯,宝鸡辰光生物科技有限公司;95%乙醇、无水甲醇,分析纯,天津欧博凯化工有限公司;甲醇、乙腈,优级纯,天津科密欧化学试剂有限公司;实验用水为去离子水。

Agilent 1260型高效液相色谱仪(C18色谱柱,250 mm×4.6 mm),美国Agilent科技有限公司;XH-300A型电脑微波超声波组合合成萃取仪,北京祥鹄科技发展有限公司;ALC-210.4型电子天平,北京赛多利斯科技仪器有限公司;微孔滤膜(0.45 μm),天津杉羽科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵,巩义予华仪器有限责任公司。

1.2 重楼皂苷Ⅰ的提取

重楼自然晾干,50 ℃烘至恒重,粉碎过筛,得粗粉,置于干燥器储存备用。称取1.00 g重楼粗粉置于50 mL洁净干燥的三颈烧瓶中,加入一定量的乙醇,在萃取仪中提取一定时间,冷却至室温,抽滤,滤液用乙醇定容至50 mL容量瓶中,即得重楼皂苷Ⅰ提取液。

1.3 重楼皂苷Ⅰ的微波提取工艺优化

采用单因素实验,分别考察乙醇体积分数、微波功率、微波温度、微波时间和料液比对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响。

在单因素实验的基础上,固定微波功率为300 W,选择乙醇体积分数(A)、微波温度(B)、微波时间(C)和料液比(D)为考察因素,以重楼皂苷Ⅰ提取率为评价指标,设计4因素3水平正交实验,进一步优化重楼皂苷Ⅰ的微波提取工艺。

1.4 重楼皂苷Ⅰ提取率的测定

1.4.1 色谱条件

Agilent C18色谱柱;流动相为乙腈-水(30∶70,体积比);检测波长203 nm;体积流量1 mL·min-1;柱温30 ℃。

1.4.2 重楼皂苷Ⅰ标准曲线的绘制

精密称取重楼皂苷Ⅰ对照品2.0 mg,用甲醇溶解后定容于5 mL容量瓶中,摇匀,得浓度为0.40 mg·mL-1的重楼皂苷Ⅰ对照溶液。分别准确吸取4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL重楼皂苷Ⅰ对照溶液,按1.4.1色谱条件进样分析,记录峰面积,以重楼皂苷Ⅰ含量(x,μg)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线(图1),拟合得线性回归方程:y=437.88x+39.4,R2=0.9965。表明重楼皂苷Ⅰ含量在 1.60～8.00 μg范围内与峰面积线性关系良好。

图1 重楼皂苷Ⅰ的标准曲线Fig.1 Standard curve of polyphyllin Ⅰ

1.4.3 重楼皂苷Ⅰ提取率的计算

移取适量重楼皂苷Ⅰ提取液,经0.45 μm微孔滤膜过滤;准确吸取10 μL,按1.4.1色谱条件进样分析,记录峰面积,根据标准曲线方程计算重楼皂苷Ⅰ含量,按下式计算重楼皂苷Ⅰ提取率(η):

式中:m为重楼皂苷Ⅰ的质量,μg;V为重楼皂苷Ⅰ提取液体积,mL;m粉为重楼粗粉的质量,g。

2 结果与讨论

2.1 HPLC图谱

准确吸取10 μL重楼皂苷Ⅰ对照溶液,按1.4.1色谱条件进样分析,HPLC图谱如图2所示。

图2 重楼皂苷Ⅰ对照溶液的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectrum of polyphyllin Ⅰ control solution

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇体积分数的选择

固定微波功率250 W、微波温度60 ℃、微波时间30 min、料液比1∶20(g∶mL,下同),考察乙醇体积分数(45%、55%、65%、75%、95%)对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响,结果如图3所示。

图3 乙醇体积分数对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由图3可知,随着乙醇体积分数的增加,重楼皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;当乙醇体积分数为55%时,提取率达到最高。可能是因为,乙醇体积分数较大时,重楼粗粉中其它成分的溶出量增加,导致提取率降低。

因此,选择45%、55%、65%作为正交实验乙醇体积分数的3个水平。

2.2.2 微波功率的选择

固定乙醇体积分数55%、微波温度60 ℃、微波时间30 min、料液比1∶20,考察微波功率(150 W、200 W、250 W、300 W、350 W)对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响,结果如图4所示。

图4 微波功率对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由图4可知,随着微波功率的增大,重楼皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;当微波功率为300 W时,提取率达到最高。可能是因为,增大微波功率加速了对细胞壁的破碎作用,提高了活性成分的溶出率,提取率相应升高;但微波功率过大时,会引起植物组织内部的微小导管因凝固而闭塞[11],使活性成分的溶出受到抑制,导致提取率降低。当微波功率从250 W增至300 W时,提取率变化不明显,但微波功率较大时更有利于活性成分的溶出。因此,选择最佳微波功率为300 W。

2.2.3 微波温度的选择

固定乙醇体积分数55%、微波功率300 W、微波时间30 min、料液比1∶20,考察微波温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响,结果如图5所示。

图5 微波温度对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响Fig.5 Effect of microwave temperature on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由图5可知,随着微波温度的升高,重楼皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;当微波温度为70 ℃时,提取率达到最高。这是因为,升高温度有利于提取溶剂对活性成分的溶解和扩散;但温度过高时,不但会影响活性成分的稳定性,而且会使重楼粗粉中其它成分的溶出量增加。因此,选择60 ℃、70 ℃、80 ℃作为正交实验微波温度的3个水平。

2.2.4 微波时间的选择

固定乙醇体积分数55%、微波功率300 W、微波温度60 ℃、料液比1∶20,考察微波时间(15 min、20 min、25 min、30 min、35 min)对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响,结果如图6所示。

图6 微波时间对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响Fig.6 Effect of microwave time on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由图6可知,随着微波时间的延长,重楼皂苷Ⅰ提取率先升高后略微降低;当微波时间为30 min时,提取率达到最高。这是因为,延长微波时间有利于植物细胞的破碎,进而有利于活性成分的溶出;但微波时间过长时,其它成分的溶出量也增多。因此,选择25 min、30 min、35 min作为正交实验微波时间的3个水平。

2.2.5 料液比的选择

固定乙醇体积分数55%、微波功率300 W、微波温度60 ℃、微波时间30 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响,结果如图7所示。

图7 料液比对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响Fig.7 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphyllinⅠ

由图7可知,随着料液比的减小,即溶剂用量的增加,重楼皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;当料液比为1∶15 时,提取率达到最高。这是因为,当溶剂用量增加时,活性成分扩散到溶剂中的机会增多,提取率相应升高。因此,选择1∶10 、1∶15 、1∶20作为正交实验料液比的3个水平。

2.3 正交实验结果

正交实验结果与分析见表1,方差分析见表2。

表1 正交实验结果与分析

表2 方差分析

由表1、表2可知,各因素对重楼皂苷Ⅰ提取率影响的大小顺序为:微波温度(B)>乙醇体积分数(A)>料液比(D)>微波时间(C)。微波温度和乙醇体积分数对重楼皂苷Ⅰ提取率的影响显著,而料液比和微波时间的影响不显著。最佳提取工艺组合为A1B3C3D2,即乙醇体积分数45%、微波温度80 ℃、微波时间35 min、料液比1∶15。

2.4 工艺验证

在上述最佳工艺条件下进行3次验证实验,重楼皂苷Ⅰ提取率分别为5.46%、5.39%、5.58%,平均提取率为5.47%,相对标准偏差(RSD)为1.75%,说明实验结果可靠。

3 结论

通过HPLC法测定重楼皂苷Ⅰ含量,以重楼皂苷Ⅰ提取率为评价指标,采用单因素实验结合正交实验优化了重楼中活性成分重楼皂苷Ⅰ的微波提取工艺。确定最佳提取工艺为:乙醇体积分数45%、微波功率300 W、微波温度80 ℃、微波时间35 min、料液比1∶15(g∶mL),在此条件下,重楼皂苷Ⅰ提取率达到5.47%。该方法操作简单、省时、高效,可用于重楼皂苷Ⅰ的提取。