改变培养条件下藻栖棘孢木霉cf44-2中的没药烷类倍半萜衍生物的分离纯化与鉴定

于汶莉,宋银平,季乃云

(1.中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003;2.中国科学院大学,北京 100049)

木霉属真菌种类及次级代谢产物具有多样性、复杂性和丰富性特点,已从木霉属真菌中分离、鉴定了许多结构新颖的次级代谢产物,包括萜类、聚酮类、甾体类、生物碱类、肽类等[1-2],其中萜类化合物含量较丰富[3]。近年来,一些结构骨架独特、取代类型新颖的萜类化合物陆续在海洋木霉中被发现[4-5],这些新的萜类化合物具有多种生物活性,如抗菌活性、细胞毒活性以及对海洋浮游生物的抑制活性等[4-7]。

海洋来源的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是已知次级代谢产物较为丰富的真菌,已鉴定出新化合物90多个,结构类型涵盖倍半萜、二萜、甾体、聚酮、生物碱和肽类[8-16]。棘孢木霉cf44-2是从舟山群岛褐藻门马尾藻属海藻(Sargassumsp.)的内部组织中分离得到的1株内生真菌,此前对其次级代谢产物研究时得到了包括甾体类衍生物(tricholumin A)、环橙花烷类倍半萜(9-cycloneren-3,7,11-triol、11-cycloneren-3,7,10-triol、7,10-epoxycycloneran-3,11,12-triol)、没药烷类倍半萜(trichaspin、trichaspside A、trichaspside B、bisabolan-1,10,11-triol、12-nor-11-acetoxybisabolen-3,6,7-triol)等新化合物[13-15],但从该菌株中发现的没药烷类倍半萜的数量少于其它同种菌株。为深入挖掘海洋藻栖棘孢木霉cf44-2中倍半萜类化合物的化学多样性,作者通过改变培养条件,获得一系列结构多样的没药烷类倍半萜衍生物,并对其结构进行鉴定。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

GF-254硅胶板、硅胶填料(100～200目、200～300目),青岛海洋化工厂;Sephadex LH-20填料,GE公司;RP-18填料,YMC公司。

除色谱级甲醇和色谱级乙腈外,其余均为分析纯有机试剂,上海国药集团化学试剂有限公司。

Bruker AVANCE Ⅲ 500型超导核磁共振波谱仪(1HNMR为500 MHz,13CNMR为125 MHz);Agilent 1260型高效液相色谱系统(Eclipese SB-C18色谱柱,9.4 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 菌株与培养基

棘孢木霉cf44-2,自舟山群岛近岸采集的褐藻门马尾藻属海藻(Sargassumsp.)的内生丝状真菌,鉴定信息参见文献[15],菌株序列已提交Genbank数据库(序列号:MG696741),现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC:M 2017360)。

大米固体培养基:1 L培养瓶中加入大米20 g、蒸馏水20 mL、陈海水20 mL、蛋白胨0.6 g。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

选用大米固体培养基培养菌株cf44-2,共培养200瓶(1 L),在25 ℃下静态培养40 d。

1.3.2 发酵产物的分离纯化

菌株cf44-2静态培养40 d后,加入200 mL乙酸乙酯,浸泡48 h;抽滤,将菌丝体与液体分开;液体用乙酸乙酯反复萃取3次后,有机相减压浓缩,即得发酵液粗提物;菌丝体自然风干,粉碎后用二氯甲烷-甲醇(1∶1,体积比)浸泡提取,共提取3次,抽滤,有机相减压浓缩,即得菌丝体粗提物;合并发酵液粗提物和菌丝体粗提物,即得总粗提物。

将总粗提物进行硅胶柱层析,收集各组分;再经反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、硅胶柱层析、制备薄层层析(TLC检测用254 nm和365 nm暗箱三用紫外灯观察,或采用硫酸-茴香醛显色剂加热显色)、半制备高效液相色谱等方法分离纯化。

1.3.3 纯化产物的结构鉴定

通过1HNMR、13CNMR分析并比对文献数据,对纯化产物的结构进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

从棘孢木霉cf44-2发酵产物中获得8个没药烷类倍半萜衍生物,其结构式如图1所示。

图1 8个没药烷类倍半萜衍生物的结构式Fig.1 Structural formulas of eight bisabolane sesquiterpene derivatives

化合物1:无色油状。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.61(1H,dt,J=0.2 Hz、1.5 Hz,H-2),5.52(1H,dt,J=10.1 Hz、1.1 Hz,H-1),5.10(1H,t,J=7.1 Hz,H-10),1.69(3H,s,H-13),1.60(3H,s,H-12),1.28(3H,t,J=2.8 Hz,H-15),0.85(3H,dd,J=12.2 Hz、6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:134.7(C-2,CH),132.3(C-1,CH),131.5(C-11,C),124.8(C-10,CH),70.0(C-3,C),40.3(C-6,CH),38.5(C-4,CH2),36.4(C-7,CH),34.3(C-8,CH2),28.5(C-15,CH3),26.1(C-9,CH2),25.9(C-13,CH3),22.5(C-5,CH2),17.8(C-12,CH3),15.9(C-14,CH3)。通过比对,化合物1的1HNMR、13CNMR数据与文献[17]报道化合物(3S*,6R*,7S*)-zingiberenol的数据一致。此前对棘孢木霉cf44-2的次级代谢产物研究中,同样分离得到化合物1。

化合物2:无色油状。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.85(1H,m,H-2),5.10(1H,tm,J=7.0 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=12.5 Hz、4.2 Hz,H-6),1.93(3H,m,H-15),1.67(3H,s,H-13),1.59(3H,s,H-12),1.29(2H,m,H-8),0.79(3H,d,J=6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:201.3(C-1,C),161.4(C-3,C),131.6(C-11,C),127.3(C-2,CH),124.6(C-10,CH),50.0(C-6,CH),34.8(C-8,CH2),31.0(C-4,CH2),30.4(C-7,CH),26.1(C-9,CH2),25.9(C-9,CH2),24.3(C-13,CH3),22.5(C-5,CH),17.8(C-12,CH3),15.7(C-14,CH3)。通过比对,化合物2的1HNMR、13CNMR数据与文献[18]报道化合物(6R*,7S*)-2,10-bisaboladien-1-one的数据一致。

化合物3:无色油状。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.87(1H,s,H-2),3.54(1H,dd,J=10.3 Hz、2.5 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=13.1 Hz、3.9 Hz,H-6),1.95(3H,s,H-15),1.21(3H,s,H-13),1.15(3H,s,H-12),0.95(3H,d,J=6.7 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:202.3(C-1,C),162.6(C-3,C),127.2(C-2,CH),76.6(C-10,CH),73.0(C-11,C),51.8(C-6,CH),31.4(C-4,CH2),28.6(C-9,CH2),28.4(C-7,CH),28.2(C-8,CH2),26.7(C-13,CH3),24.3(C-15,CH3),23.4(C-12,CH2),22.6(C-5,CH2),17.2(C-14,CH3)。通过比对,化合物3的1HNMR、13CNMR数据与文献[19]报道化合物trichodone A的数据一致。

化合物4～8:均为无色油状。通过1HNMR、13CNMR数据分析并结合文献数据,发现与trichobisabolin Z(4)、trichobisabolin Q(5)、trichobisabolin N(6)、trichobisabolin S(7)、trichobisabolin M(8)数据一致,相关波谱数据见文献[20-21]。

2.2 讨论

棘孢木霉是海洋木霉属真菌中的重要一员。目前,涉及次级代谢产物的海洋来源棘孢木霉至少有6株(dl-34、Y6-2、A-YMD-9-2、cf44-2、Y19-07或17以及1株未编号的棘孢木霉),其中有4株为藻栖棘孢木霉。已报道的海洋来源棘孢木霉次级代谢产物具有高度的新颖性和多样性,包括倍半萜及其衍生物、二萜、聚酮、多肽等。其中倍半萜及其衍生物占绝大多数且种类丰富,包括21个没药烷类倍半萜、24个环橙花烷类倍半萜、2个杜松烷类倍半萜等[4,8-16,22-24]。Song等[9-12]在研究藻栖棘孢木霉A-YMD-9-2的次级代谢产物时,以大米为基质对菌株进行培养,发现了7个新的没药烷类倍半萜、16个新的环橙花烷类倍半萜及4个已知的环橙花烷类倍半萜。

藻栖棘孢木霉cf44-2在此前的研究中以马铃薯为基质进行发酵培养,得到了包括1个甾体类衍生物、3个环橙花烷类倍半萜、5个没药烷类倍半萜在内的新化合物[13-15],其中没药烷类倍半萜相较于其它同种菌株的数量较少。众所周知,培养条件不同对真菌次级代谢产物具有显著影响[25-26]。基于此,Shi等[16]以土豆为基质对棘孢木霉Y6-2进行培养,发现了8个新的没药烷类衍生物。本研究通过改变培养条件,选用大米固体培养基对棘孢木霉cf44-2进行培养,除同样获得化合物1外,新代谢产生了7个新的没药烷类倍半萜衍生物,其中含5个降没药烷倍半萜。由此可以推测,以大米为基质对棘孢木霉cf44-2进行培养,在一定程度上可以增加其次级代谢产物中没药烷类倍半萜的数量及结构多样性;不同棘孢木霉的代谢产物类型受菌株自身代谢以及培养条件的影响。

本研究首次发现藻栖棘孢木霉cf44-2为产化合物1和2的木霉菌株,而此前该类化合物是在研究蝽虫(Halyomorphahalys)信息素时获得的[17-18]。trichodone A(3)则是在药用植物三七(Panaxnotoginseng)的内生棘孢木霉中首次被发现[19],可见化合物3存在于不同来源的棘孢木霉中。本研究获得的8个没药烷类倍半萜衍生物中,包含5个降没药烷倍半萜,化合物4为在C11位连氧的降倍半萜,化合物5～8均为含吡喃环降倍半萜,化合物4～8在不同种类的海洋藻栖木霉中均有发现[19-20]。据文献报道,化合物4、5和7对4种海洋浮游植物(Amphidiniumcarterae、Chattonellamarina、Heterosigmaakashiwo、Prorocentrumdonghaiense)均有抑制作用,IC50值为0.54～8.4 μg·mL-1,部分化合物对柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonascitrea)及某些海洋弧菌具有抑制作用[20]。化合物6和8也具有一定抗菌活性,但对海洋浮游植物的抑制活性较弱[21]。

3 结论

在前期研究的基础上,进一步探究了海洋藻栖棘孢木霉cf44-2中倍半萜类化合物的化学多样性,以改变培养条件的方式,对其次级代谢产物进行研究。发现改变培养条件诱导菌株cf44-2产生了7个新的没药烷类倍半萜衍生物,其中部分化合物具有一定的生物活性。表明,改变培养条件是使棘孢木霉中萜类代谢产物多样化的有效途径,为今后进一步深入挖掘棘孢木霉次级代谢产物提供了依据。