多光谱成像系统法评价大白菜—甘蓝易位系叶色

刁可宁，张东方，李晓敏，申书兴，王彦华，顾爱侠

（河北农业大学 园艺学院/河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室 河北省蔬菜产业协同创新中心，河北 保定 071000）

大白菜（Brassica rapaL.ssp.pekinesis）原产于中国，属十字花科芸薹属（Brassica）白菜类蔬菜作物，是我国种植面积和消费量最大的蔬菜作物之一［1］，具有较高的药用价值和营养成分，被誉为“百菜之王”。

目前关于大白菜叶色鉴定主要是利用人眼识别法和叶绿素测量仪法进行评价［2-6］。将光谱技术与图像技术相结合作为定量、快速、无损的数据采集方法，应用于病虫害鉴定［7］、马铃薯叶片叶绿素荧光模型建立［8］、稻米氮素评价［9］等领域。Renerio等［10］使用多光谱相机对53 份菲律宾霹雳果菌毛颜色分类鉴定，该分类方法可成功识别不同菌毛颜色之间可区分的变化标准。叶片是大白菜的商品器官，同时也是光合作用器官，在长期的栽培和演化中形成了多种变异类型［11-12］，叶色是叶片重要性状，直接影响商品器官表型和植株的光合作用等［13］。因此大白菜叶色的研究具有重要的理论意义和生产价值。

本研究基于多光谱成像系统法，对大白菜—甘蓝易位系叶色进行鉴定，并与人为目测法、叶绿素测量仪法进行了比较分析，表明多光谱成像系统法能够较准确评价大白菜叶色，为开展大白菜叶色基因定位等研究提供精准的表型数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为262 份大白菜—甘蓝易位系及其亲本，于2020 年8 月播于河北农业大学实验基地，正常管理，莲座期选取生长正常、有代表性的植株的叶片进行叶色鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 多光谱成像系统法评价叶色 在群体中选择典型浅黄色、浅绿色、绿色、灰绿色、深绿色的叶片作为标准样本（图1）。利用多光谱四通道相机（AD-130GE，丹麦）同时捕获大白菜样本的可见光图像与近红外图像［14］，通过阈值分割算法［15］将叶片与背景分割，提取大白菜叶片的 RGB 三通道的灰度值以及近红外通道的灰度值，并去除大白菜叶脉的叶片区域。以红光（R）、绿光（G）、蓝光（B）与近红外（N）四通道的灰度值进行主成分分析，利用此方法可以用最少的变量代替数量众多的原始变量［16］，建立K-means 无监督学习模型，利用该模型将262 个样本与标准叶片的多光谱成像系统法四通道灰度值分为浅黄，浅绿，绿，灰绿，深绿5 类［17］。

图1 易位系5 类典型叶色Fig.1 Five typical leaf colors of the transloction lines

1.2.2 便携式叶绿素仪法评价叶色 利用叶绿素测量仪（SPAD-502plus，日本）在白菜叶片上叶肉靠近叶缘周围固定选取3 个位置（图2）进行叶绿素（SPAD）值的测定。

图2 叶绿素仪测量法取点示意图Fig.2 Schematic diagram of chlorophyll meter measurement

1.2.3 人为目测法评价叶色 通过人眼观察，将叶色按绿色深浅分为5 级，即：1 浅黄色、2 浅绿色、3 绿色、4 灰绿色、5 深绿色。

1.3 数据处理与分析

采用Excel2010 进行数据统计及处理，分别计算叶色的最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数、遗传多样性及均一度［18-19］；多光谱成像系统法四通道灰度值及叶绿素仪测量法所得SPAD 值采用有监督K-means 均值聚类法；使用Matlab2015b软件对叶色各类相关性状指标进行统计分析，获得混淆矩阵图,利用Origin2021 作图，采用SPSS23.0对性状进行多样性鉴定及不同相关性状的相关性分析。

以H′ (Shannon’s diversity index) 和J(Pielou’s evenness index)来评价群体内某性状的多样性和均一度。计算公式为：

将所有材料数据计算平均值和标准差，每0.5σ为一级，算Shannon-Wiener 多样性指数（H′），其中P.指某个性状在第i个级别出现频率。

2 结果与分析

2.1 多光谱成像系统法评价叶色

提取262 份试验材料叶片中红光（R）、绿光（G）、蓝光（B）与近红外（N）每个叶片的4 个灰度值，利用SPSS 处理多光谱成像系统法4 组数据后得到4 个主成分（表1），第一主成分累计贡献率为71.580%，说明该主成分贡献率基本能够代表其他原始变量性状的综合信息，作为叶色分类的依据。

表1 主成分累计贡献率Table 1 Accumulated contribution rate of principal components

根据262 份易位系材料多光谱成像系统法测定的灰度值，使用Origin 2021 作图绘制叶片颜色的空间散点图。由图3 可明显看出，各颜色分布具有较强的区域分布。

图3 基于多光谱成像系统法灰度值的叶片颜色空间散点图Fig.3 Scatter diagram of leaf color based on grey value of multispectral imaging system

2.2 人为目测评价易位系叶色

人为目测法将262 份大白菜易位系叶色分为5类，包括浅黄色、浅绿色、绿色、灰绿色、深绿色，其中绿色占比66.4%，浅绿占比14.5%，灰绿（11.8%）、深绿（3.1%）和浅黄（4.2%）共占19.1%。易位系叶色变异系数为29.77%，多样性指数为1.04，均一度为0.64，说明262 份大白菜易位系间存在丰富的叶色多样性。

2.3 便携式叶绿素仪法评价叶色

利用便携式叶绿素仪法对262 份大白菜—甘蓝易位系叶色进行评价（表2）。

表2 便携式叶绿素仪法测量方差及多样性分析Table 2 Analysis of variance and diversity of chlorophyll meter measurement

叶色值从1.5 到44.3，变化范围较大，变异系数为20.66%，说明材料具有丰富的叶色多态性。多样性指数和均一度分别为1.9 和0.82，均高于人为目测法。

2.4 3 种叶色评价方法间的比较分析

2.4.1 3 种方法鉴定结果的相关性分析 利用SPSS软件，对人为目测法、便携式叶绿素仪法以及多光谱成像系统法3 种方法测定的叶色进行相关性分析，结果表明，3 种方法评价结果极显著相关（表3）。

表3 3 种叶色评价方法的相关性分析Table 3 Correlation analysis of three leaf color evaluation methods

2.4.2 3 种方法测量值比较 将多光谱成像系统法测定的灰度值，便携式叶绿素测量仪法测定值（SPAD值），分别进行聚类分析，聚类结果如表4。人为目测法把叶色分为了5 类，每类叶色分别赋值1、2、3、4、5；叶绿素测量仪法和多光谱成像系统法，能够从简单的分类定性，转化为连续数值的定量。如绿色，利用叶绿素测量仪法测定时，这一类叶色评价值为25.2 ～37.6，跨度值为12.4；利用多光谱成像系统法测定时，该类叶色在4 通道灰度值里的平均跨度值为30.28。较大的跨度值说明能够区分细小差别，表型鉴定亦越精准。

表4 3 种不同测量方法区间对比Table 4 Interval comparison of three different measurements

2.4.3 混淆矩阵分析 混淆矩阵是表示精度评价的一种标准格式，可从不同侧面反映测量结果的精度。每一行之和表示该类别的真实样本数量，每一列之和表示被预测为该类别的样本数量，斜对角线上的数值为2 种方法共通值。将便携式叶绿素测量仪法所得的SPAD 值、多光谱成像系统法得到的灰度值，通过K-means 聚类分析得出的5 种分类结果，以及人为目测鉴别结果，利用Matlab 2015b 软件得出混淆矩阵（图4）。如图所示，当人为目测法与多光谱成像系统法同时鉴定为绿色样本的为162 个时，叶绿素测量仪法将其中的121 个样本鉴定为绿色，6份鉴定为浅黄色，13 份鉴定为浅绿色，11 份鉴定为灰绿色，19 份鉴定为深绿色。叶绿素测量仪法是目前使用最广泛的快速测量叶色材料的鉴定方法，但该方法可能受到叶片厚度等一系列问题的影响，从而导致与人为目测法及多光谱成像系统法一致性较低的现象。

图4 3 种不同叶色评价方法分类结果混淆矩阵图Fig.4 Confusion matrix of classification results of three different leaf color evaluation methods

3 讨论与结论

多光谱成像系统已在植物多个领域中应用，Liu等［20］利用多光谱相机及不同化学方法结合，从完整番茄中对番茄红素和酚类化合物含量进行了同步和无损测量，Sun 等［21］利用多光谱成像系统成功预测植物氮磷钾含量，且相对误差在3%左右，但在大白菜上鲜有报道［22］。本研究利用具有四通道多光谱成像设备，使用AD-130GE 相机采集了262 份大白菜易位系材料的图像信息，快速完成了大白菜易位系叶色评价与分类。该方法在暗箱中进行，光照可控，可以避免其它光源对观测的影响。相比与叶绿素测量仪法点扫描，多光谱成像系统法通过不同波长提取光谱维度中不同的色彩通道得到平面，可以测得整个叶片的完整色彩信息［23］，而且避免了叶绿素测量仪法由于叶片厚度带来的影响［24］。

准确鉴定表型，是开展植物性状相关基因鉴定的前提与基础。3 种叶色鉴定方法的混淆矩阵结果表明，叶绿素测量仪法分别与多光谱成像系统法和人为目测法结果的一致，较多光谱成像系统法与人为目测法测定结果一致性低，可能受到叶片厚度、点扫描评价等因素的影响，导致叶绿素测量仪法测定法鉴定叶色时存在一定的不稳定性。

多光谱成像技术是一种具有强大信息捕获功能的新型成像检测技术，既可以实现植物的生理和生化表型定性定量分析，又可以在植物的损伤和病理病害上进行研究鉴定。利用多光谱成像系统法对叶色进行评价值为37.32 ～231.92，在数值跨度上高于人为目测及叶绿素测量仪法测量值的区间，为区分叶色的细微差别提供了基础，为大白菜叶色精准评价提供方法。