凋亡胞外囊泡在炎症与肿瘤发生、发展中的作用研究进展

王玺惠 陈依 俞卫锋

凋亡是生物体内细胞进行的自发、有序的死亡过程，它在维持内环境稳态和调节细胞增殖周期中发挥重要作用[1]。细胞凋亡不仅存在于胚胎发育、细胞分化、组织再生、器官发生等各个生理阶段，也发生于肿瘤、免疫缺陷、器官萎缩等病理过程中[2]。细胞凋亡伴随着细胞核固缩、碎裂向细胞质释放，随后形成含固缩核碎片的囊泡分泌到细胞外，同时凋亡细胞也会分泌一种仅包含细胞质结构致密的圆形囊泡。它们被巨噬细胞或邻近细胞吞噬或随细胞外液向远处传递[3]。在随后的研究中，人们发现这些囊泡可以作为凋亡细胞产生的重要细胞通信载体，参与调节凋亡细胞对自身和周围细胞的凋亡和再生过程，以及影响病理状态下组织的炎症反应和肿瘤发展[4]。细胞外囊泡是细胞分泌的各种球状或杯状的含有质膜结构的囊泡，可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体3 种类型[5]。凋亡胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles，Apo-EVs）是微囊泡的一种特殊亚型，与其他囊泡在形成、结构和功能等方面均有差异。尽管Apo-EVs 在直径上与外泌体有部分重叠，但它们的分泌方式并不相同，相比于外泌体需要通过内吞体分选复合体机制和腔内囊泡机制分泌到细胞外，Apo-EVs 可以直接从凋亡细胞的质膜脱落产生[6]。此外，Apo-EVs 与凋亡小体均产生于凋亡细胞，但是凋亡小体的直径通常＞1 μm，并且包含大量核糖体RNA，而Apo-EVs 直径0.05～1 μm，主要包含非核糖体非编码RNA 比如内源性逆转录因子RNA、非编码RNA 以及Alu 重复序列等[7]。Apo-EVs作为凋亡细胞的特有产物，一方面携带与凋亡相关的标志物，一方面携带供体细胞的蛋白、脂质、核酸以及细胞器[8]。因此，Apo-EVs 既可以协助巨噬细胞清除凋亡产物[9]，也可以转运生物活性分子（如蛋白质和核酸）或将供体细胞产生的信号进行传递，实现细胞-细胞间交流[10]，在凋亡细胞清除、细胞再生、免疫反应调控、肿瘤生长调节等病理生理过程中发挥重要作用。

1 Apo-EVs 的形成与分泌调节

1.1 Apo-EVs 的形成 细胞凋亡程序通过半胱氨酸蛋白酶（Caspase）激活启动[11]，当细胞收到凋亡信号后，会发生明显的形态学变化：细胞收缩、细胞核和染色质凝结、细胞核和细胞器破裂、细胞膜脱落和囊泡形成[12]。凋亡囊泡的形成发生在细胞凋亡末期，分为3 个阶段。第一阶段：凋亡囊泡形成的启动阶段，该阶段涉及多个凋亡相关的信号通路的调控作用，具体机制尚不明确，已经确定的有Caspase 介导的ROC 相关激酶-Ⅰ（Rho-associated kinase-Ⅰ，ROCK-Ⅰ）和p21活化蛋白激酶-2 裂解，激活下游效应因子Rho 和Rac/Cdc42，参 与 囊 泡 的 形 成[13]。Caspase-3 通 过 切 割ROCK-Ⅰ，促使LIM 激酶1 磷酸化激活，进而诱导丝切蛋白磷酸化，以调节肌动蛋白重组[13-14]。第二阶段：囊泡形成阶段，信号分子促使肌动蛋白-肌球蛋白系统产生收缩力，协助DNA 片段从核区域进入细胞质。伴随细胞局部静水压力的改变，细胞膜局部膨大突起，细胞特异性细胞质在质膜上形成纺锤形结构[15]。同时，功能微管促进核收缩，使核内或胞内物质进入突起膜泡结构成为核周多囊内体[16]。第三阶段：Apo-EVs 分泌阶段，质膜与肌动蛋白皮质分离并继续扩张，与此同时肌动蛋白皮质在质膜下迅速重新组装，阻止质膜的持续膨胀。在这种扩张和收缩的双重调节下，细胞碎片被包装成凋亡囊泡[17]。此外，凋亡囊泡的生物形成还伴随着细胞脂质双分子层磷脂酰丝氨酸的外翻并与Annexin V 结合[18]。因此，Apo-EVs 表面会特异性表达与凋亡相关的信号分子，如磷脂酰丝氨酸、Annexin V、Caspase 3、钙网蛋白和核纤层蛋白B1[19]。

1.2 Apo-EVs 的分泌调节 Apo-EVs 的分泌主要依赖于细胞凋亡调节信号或肌动蛋白运动抑制剂等。Caspase 抑制剂能够抑制与凋亡发展相关的核变化，并且不增加细胞膜的通透性，表明抑制Caspase 不会诱导细胞转向坏死，而是通过抑制凋亡的方式减少Apo-EVs 的产生[20]。ROCK-Ⅰ通过激活肌动蛋白-肌球蛋白收缩来驱动Apo-EVs 形成，因此，使用ROCK 抑制剂可以通过抑制该过程，进而抑制Apo-EVs 形成。此外，肌动蛋白聚合抑制剂和非肌肉肌球蛋白Ⅱ抑制剂作为干扰肌动蛋白-肌球蛋白收缩的药物，也能抑制Apo-EVs 分泌。

2 Apo-EVs 的生物学功能

2.1 招募巨噬细胞和清除凋亡细胞及产物 细胞在凋亡过程中会释放可溶性的“find-me”信号，驱使巨噬细胞向凋亡细胞迁移，同时也会释放“eat-me”信号，促使巨噬细胞吞噬分解产物[21]。Apo-EVs 作为凋亡细胞释放的囊泡，会携带部分“find-me”和“eat-me ”信号，协助凋亡细胞清除、减轻炎症反应以及维持稳态[22]。据报道，饱和脂肪酸刺激的脂肪细胞会释放Apo-EVs，它们刺激并趋化单核细胞和原代巨噬细胞，促使肥胖相关的巨噬细胞大量浸润，这提示了Apo-EVs 可携带“find-me”信号在趋化巨噬细胞中起作用[23]。1-棕榈酰-2-亚油酰-3-乙酰甘油（1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol，PLAG）作为中性粒细胞分泌的Apo-EVs 所携带的“find-me”信号，促使巨噬细胞中P2Y2 受体从脂筏（一种富含胆固醇和鞘磷脂并与膜的信号转导、蛋白质分选密切相关的微结构域）转向非脂筏质膜域，激活巨噬细胞向中性粒细胞迁移，进而清除凋亡的中性粒细胞，减弱过度激活的免疫反应以及继发的慢性炎症[24]。此外黏附分子、乳脂球表皮生长因子等也被证实是Apo-EVs 携带的“find-me”信号之一[25-26]。

Apo-EVs 也携带有“eat-me”信号的载体，促使凋亡细胞被清除。2 型糖尿病患者的间充质干细胞可以分泌Apo-EVs，可携带钙网蛋白作为一种重要的“eatme”信号，介导巨噬细胞内吞Apo-EVs，促使巨噬细胞在转录水平上转化为2 型糖尿病肝脏中的抗炎表型。最终可减缓包括葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗在内的2 型糖尿病表型的疾病进展[27]。

2.2 促进组织再生 组织再生常伴随着细胞的增殖、分化和凋亡。其中，凋亡在组织形态重塑中起到至关重要的作用[28]。凋亡细胞如干细胞、免疫细胞、前体细胞、成骨细胞和内皮细胞等产生的胞外囊泡可以通过转运生物活性分子，或者通过调节增殖相关信号通路的方式促进皮肤、骨骼、肌肉组织再生[29]。Ma 等[19]研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路在皮肤和毛发发育中起着关键作用，而皮肤和毛囊的间充质干细胞释放的Apo-EVs 可以激活Wnt/β-catenin 通路，促进皮肤和毛囊代谢，加速伤口愈合和毛发生长。乳牙牙髓干细胞中的Apo-EVs 携带线粒体Tu 翻译延伸因子，被内皮细胞内化后上调血管生成相关因子的表达，增强内皮细胞血管生成的能力，促进牙髓血管重建和组织再生[30]。在病理情况下，Apo-EVs 也有促进细胞增殖和组织修复的作用。凋亡的内皮细胞释放富含肿瘤易感基因101 和翻译控制肿瘤蛋白的Apo-EVs，它们在血管平滑肌细胞中产生细胞外调节蛋白激酶依赖的抗凋亡作用，并促进血管修复[31]。宫颈癌细胞系Hela 细胞，释放富含CT10 相关激酶Ⅰ的Apo-EVs，并将其传递给邻近细胞，通过激活c-Jun 氨基末端激酶的方式发挥促进细胞增殖的作用[32]。总之，凋亡细胞分泌的Apo-EVs不仅有助于组织的生长和修复，还会影响肿瘤的生长。

2.3 调控炎症反应 死亡细胞或损伤组织介导的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以刺激周围的细胞或组织诱发非感染性炎症（即无菌性炎症）。过去人们认为DAMPs 是细胞坏死导致的，然而最新的研究发现，在特定条件下，尤其是当组织发生大量继发性凋亡或免疫原性细胞死亡时，凋亡细胞也会诱导炎症或免疫原性反应[33]，并且这种作用与凋亡细胞释放的Apo-EVs 有关[10]。

Apo-EVs 携带凋亡细胞的抗原，如自身免疫抗原、病原体抗原、肿瘤相关抗原，将其传递给免疫细胞，导致炎症反应。由于Apo-EVs 高表达磷脂酰丝氨酸，所以其可以更高效地被递呈细胞吞噬[34]。在自身免疫性疾病中，Apo-EVs 通过微管结构和肌球蛋白轻链激酶的作用，负载来自供体细胞的自身免疫病相关抗原[16]。通过这种方式，Apo-EVs 使自身抗体在体内积累，导致免疫耐受功能失调，炎症反应加重。比如，干燥综合征患者分泌的Apo-EVs，携带抗α-胞衬蛋白抗体、抗SS-A 抗体以及自身抗原hy1-RNA，并将其转移给树突状细胞，进而影响参与非特异性免疫的Toll 样受体-7/9的表达和促炎细胞因子的产生[35]。

感染细胞释放的Apo-EVs 通过将感染因子抗原传递给抗原递呈细胞，刺激机体产生免疫反应。比如，结核分枝杆菌使CD1 阴性的巨噬细胞失去抗原递呈能力并且诱导其凋亡，这些凋亡的巨噬细胞会释放包含病原体抗原的Apo-EVs，并将其传递给未感染的树突状细胞以及活化的CD8 T 细胞，两者作为抗原递呈细胞，激活免疫系统，产生炎症反应[36]。在病毒感染时，Apo-EVs 携带感染性病毒，并转移给邻近细胞，从而加快病毒的繁殖并保护其免受免疫系统攻击或者导致免疫反应异常并产生自身免疫反应。基孔肯雅病毒感染的Hela 细胞凋亡并分泌携带病毒抗原的Apo-EVs，感染邻近巨噬细胞，抑制其发挥炎症保护作用，这提示了携带病原体抗原的Apo-EVs 不仅可以促使免疫细胞发生免疫反应，也能促使机体对病原体形成免疫耐受[37]。

Apo-EVs 会触发抗移植物抗体产生，加速排斥反应。例如，凋亡的内皮细胞产生Apo-EVs，通过携带20S 蛋白酶体诱导抗移植抗体的产生，增强了主要组织相容性复合体形成，并促进主动脉移植小鼠中抗移植抗体的产生和同种异体移植炎症的形成[38]。

Apo-EVs 也可以通过携带免疫调节因子，直接作用于炎症细胞，调节免疫反应的不同过程。比如，微血管内皮细胞释放的Apo-EVs 通过激活内皮细胞NFκB 相关通路，促使内皮细胞表达与细胞死亡、炎症、分化和细胞运动相关的基因，从而产生抑制凋亡，改善伤口闭合，降低血管生成活性以及减少与内皮-间充质转化相关的内皮标志物表达的作用[39]。凋亡细胞释放的Apo-EVs 通过携带的DNA 等与人浆细胞样树突状细胞上Toll 样受体9 结合，促使其分泌干扰素-α，最终调节炎症反应[40]。另有研究发现多核中性粒细胞释放的Apo-EVs 协同TNF-α 参与促进巨噬细胞极化和炎症反应发生[41]。与之相反的是，骨髓间充质干细胞中的Apo-EVs 通过AMPK/SIRTI/NF-κB 通路抑制促炎巨噬细胞极化以及TNF-α 分泌，抑制邻近破骨细胞的形成[42]。间充质干细胞来源的Apo-EVs 被巨噬细胞吞噬清除，随后在转录水平诱导巨噬细胞重编程，调控肝巨噬细胞稳态，促进巨噬细胞向抗炎症表型转化，从而延缓2 型糖尿病发展[27]。Hela 细胞释放的Apo-EVs 携带鞘氨醇-1-磷酸受体1 和3 与巨噬细胞接触后，诱导IL-1β分泌，促进炎症反应发生[10]。

2.4 影响肿瘤发生、发展 在肿瘤组织中，Apo-EVs携带供体细胞内容物或表面标志物，通过胞吞的方式将特异的信号传递给受体细胞，发挥调控肿瘤生长的作用。Apo-EVs 可以通过直接调节肿瘤细胞增殖或凋亡，或者间接地通过调节肿瘤间质细胞或免疫细胞，改变肿瘤生长微环境的方式，影响肿瘤生长和转移。

Apo-EVs 直接作用于邻近的肿瘤细胞，改变受体细胞增殖能力。胶质母细胞分泌的Apo-EVs 富含各种剪接体成分RNA 结合基序蛋白11，它们具有改变受体细胞中的RNA 剪接的作用。因此，Apo-EVs 通过改变受体细胞RNA 剪接，促进肿瘤细胞增殖并增强其耐药性[43]。

通过调节肿瘤生长微环境的方式，间接调节肿瘤生长也是Apo-EVs 的作用方式之一。上皮性卵巢癌细胞分泌的Apo-EVs 含有丰富的CD147，可以诱导基质金属蛋白酶形成，分解细胞外基质，最终产生促进血管生成，加速恶性肿瘤发展的作用[44]。在实体瘤和白血病分泌的Apo-EVs 中含有凝血调节剂——组织因子，导致血液抗凝能力降低，促使血液形成高凝状态，增加癌栓形成和肿瘤定植风险[45]。同样，黑色素瘤产生的Apo-EVs 也被证明有外源性促凝作用，其形成凝血酶原复合物会激活早期阶段的凝血反应，促进肿瘤形成癌栓[34]。

Apo-EVs 对免疫系统的调控作用，也是影响肿瘤生长的重要因素。淋巴瘤细胞衍生的Apo-EVs 携带了肿瘤相关抗原，并被脾脏CD169+巨噬细胞亚群捕获，抑制树突状细胞介导的体内细胞毒性反应，最终建立免疫耐受[46]。Apo-EVs 也可以通过促进异位生发中心形成，增强免疫系统的监视作用。实体肿瘤患者在内皮细胞的血管损伤后，会产生携带活性20S 蛋白酶体的Apo-EVs，其将信号传递给γδT 细胞，促使γδT 细胞迁移到损伤部位并产生有助于损伤部位三级淋巴样结构形成和成熟的细胞因子IL-17，使局部产生活跃的免疫反应，加强免疫细胞对肿瘤的清除能力[47]。

3 小结和展望

细胞凋亡是组织生长以及维持内环境稳态的重要程序。Apo-EVs 形成作为细胞凋亡的环节之一，Apo-EVs 携带DNA、RNA 和蛋白质等物质，并且含有特异性蛋白标志物的膜结构，可将特异性的内容物运送至靶器官或靶细胞，在组织发育和再生、炎症和肿瘤等疾病中发挥重要作用。与细胞直接释放细胞因子和生长因子到组织间隙相比，Apo-EVs 传递的信号减少了“信号稀释效应”，使生物活性分子可以更高效地作用于邻近的细胞或远处的组织。然而，对于Apo-EVs 的作用方式及细胞间通讯的机制仍未完全明确。关于Apo-EVs 的研究存在一些挑战，首先，凋亡细胞释放的Apo-EVs 与正常细胞释放的外泌体在技术层面上很难区分。其次，由于Apo-EVs 共同表达与凋亡相关的标志蛋白，并且可能不携带供体细胞特有的标记蛋白，因此很难区分体液中Apo-EVs 的来源。此外，由于坏死细胞也会释放一些囊泡，因此很难辨别囊泡来源于凋亡细胞还是坏死细胞。综上所述，关于Apo-EVs 的形成和作用机制尚需要进一步探索，Apo-EVs 向临床应用的转化任重而道远。