金华火腿中单增李斯特菌的风险评估

李银辉，张红敏, ，孟媛媛，薛 甜，王晔茹，白 莉，李 豪，谢家莹，刘海泉,3,4，谢庆超,3,5, ，赵 勇,3,5,

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.国家食品安全风险评估中心，北京 100022；3.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306；4.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；5.上海海洋大学食品质量安全检测实验室，上海 201306）

单增李斯特菌是一种能导致侵袭性李斯特菌病的食源性致病菌，受污染的即食食品是人类李斯特菌病的高风险来源[1]。自20 世纪80 年代以来，单增李斯特菌对食品行业产生了巨大的经济影响，人类李斯特菌病的暴发与受污染食品的关联一直被卫生部门所关注[2]。目前国外诸多学者对发酵肉制品中单增李斯特菌进行了污染情况调查，总体污染率为3.29%，其中欧洲的污染率为2.82%，美洲的污染率为7.50%[2-4]；根据我国污染物检测网2010～2020 年的相关资料[5-7]显示，生禽肉、即食肉制品和即食凉拌菜中都不同程度的受到单增李斯特菌污染，其中发酵肉制品的总体污染率为0.82%。对以上国内外研究结果进行比较分析后，发现猪肉以及猪肉制品中单增李斯特菌是较为常见且危害较大的食源性致病菌。

发酵火腿是以猪腿肉为原料，在特定微生物和酶的作用下，经过较长时间的腌渍发酵处理后制成的具有独特风味的产品。中式发酵火腿品类繁多，是我国重要的发酵肉制品，由于不同的习俗，各地加工工艺有细微差异，但加工原理基本一致[8]，其中金华火腿是中式发酵火腿的典型代表，因其具有独特的色、香、味、形在国内外享有盛名。2008 年通过并实施了修订后的GB/T 19088-2008《地理标志产品 金华火腿》，其中描述的是经传统加工方式制成的火腿。但随着科技的进步，现代化的加工工艺逐步取代传统加工工艺成为主流，实现了中式发酵火腿产品规模化，标准化的量产，从而成为人们餐桌上的常见美食[9]，但针对现代生产工艺过程中各个环节的食品安全风险研究较少。同时关于发酵火腿的研究中，多以其理化指标的表征以及保健作用的探究为主，而对其中食源性致病菌的定量风险评估的报道同样较少。发酵火腿生产过程较长，易造成病源微生物的污染，再加上部分地区有生食的习惯，因此亟需对发酵火腿中单增李斯特菌进行风险评估[10]。

本研究以金华火腿为研究对象，通过模拟现代工艺金华火腿生产销售的全过程，如腌渍、发酵成熟、销售贮藏环节中单增李斯特菌的生长可能性及污染程度，用概率分布进行描述。对金华火腿中单增李斯特菌进行初步定量暴露评估，并对即食金华火腿切片进行定量风险评估，以期为发酵火腿中食源性致病菌的风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源

1.1.1 初始污染量 我国猪肉中单增李斯特菌污染率和污染水平等数据主要通过查阅国内外相关的调研报告[11-12]；用Beta 分布描述其污染率，用PLm进行表示。用累积分布函数描述阳性样品中单增李斯特菌的污染水平，并用CLmM+（lg CFU/g）表示。为了计算阴性样品中该菌的浓度（CLmM-），采用Jarvis 等式计算阴性样品中的实际污染水平[13]，公式如下：其中，M 表示阴性样品中单增李斯特菌的真实浓度（lg CFU/g），V 表示检测时所使用的样品量（g），Z 表示阴性样品数量，N 表示检测样品总量，用反向偏斜累积概率分布（Left-handtailed cumulative）描述阴性样品中单增李斯特菌的浓度。生猪肉中单增李斯特菌的污染水平（NLm）采用离散函数Discrete（CLmM+:CLmM-, PLm:（1-PLm））进行表示[14]。

1.1.2 加工及销售过程中相关参数 本研究主要参考金华火腿的现代加工工艺，包括原料预处理、腌制、发酵成熟等基本过程[9,15]。制作过程中pH、水分活度（Water activity，aw）、温度，以及发酵过程中乳酸菌的浓度等参数从国内外有关金华火腿的文献资料中获得。采用下文中的微生物预测模型模拟现代工艺条件下单增李斯特菌在金华火腿中的生长概率及存活数量[16-20]。

火腿制作过程的第一步是将猪腿肉进行腌制，腌制的作用是使肉中的水与盐接触，将盐扩散到肌肉组织中。腌制的时间根据不同类型火腿的工艺而有所差异，金华火腿的腌制期通常为20～30 d[21]。腌制期间内部及表面没有检测到乳酸菌，所以在腌制过程中不考虑乳酸菌的影响，而在腌制完成之后，表面和内部微生物数量增加[22]。火腿在腌制过程中的pH是动态变化的（最大值6.14，最小值5.72），在火腿内部测量的aw水平在0.92 到0.992 之间，但在其表面的aw小于0.94（范围为0.64～0.94），腌制过程中温度为4～10 ℃[9]。腌制时间（Timesal）和腌制时的温度（Tsal）用Uniform 函数进行描述；腌制时的水分活度（awsal）和pHsal值用Pert 函数进行描述。

金华火腿在发酵成熟过程中经历了微生物的生长演替，许多研究表明乳酸菌可以抑制单增李斯特菌的生长，抑制方式主要通过细菌竞争、产酸和产生细菌素等[23]。金华火腿发酵成熟过程中，火腿表面微生物迅速增加，进入发酵期后乳酸菌的数量在较短时间内增加至6 lg CFU/g，随着发酵的进行乳酸菌的数量下降至3 lg CFU/g 并维持很长一段时间，发酵成熟后乳酸菌数量降至较低水平[22,24]。本研究中，用Pert函数来描述发酵成熟过程中乳酸菌的数量。发酵成熟过程于温控房中进行，温度控制在10～30 ℃之间，发酵成熟时间一般为45～80 d[25]。根据发酵过程中乳酸菌的水平（NLABf）、发酵温度（Tf）、pHf和发酵过程中水分活度（awf）等参数模拟了单增李斯特菌的生长状况[26-27]。

发酵成熟期后，金华火腿会被分发给零售商，这一过程通常在室温下进行。采用Triang 分布模拟全国气温分布[28]，并假设该产品的零售期为7～8 个月。火腿储存期间pH 在5.54～6.55 之间变化，水分活度（awret）最小为0.857，最大为0.986。储藏过程中乳酸菌初始量相对较少，生长缓慢，大部分时期保持在2 lg CFU/g 的水平；本次评估中假设储存销售期间乳酸菌的数量不变。

1.1.3 消费及人口数据 第七次人口普查显示全国总人数为1.4×109人，成人为1.1×109人，婴幼儿为1×108人，老年人为2×108人，孕妇为1.5×107人[29]。消费者每餐食用即食火腿切片的量用2016 版《中国居民膳食指南》中即食食品摄入量代表，采用Pert 函数进行表示[30]。

澳大利亚不同年龄段消费者对于酒种的偏好具有较大差异：14～17岁年龄段消费者更偏爱喝预调烈酒，但随着年龄增长，喜爱瓶装葡萄酒的消费者占比逐渐增加，而预调烈酒的占比逐渐减少。对于烈酒，14～17岁年龄段消费者消费烈酒比例占该群体总消费酒精饮料的60%，为各年龄阶段群体中最高。但随着年龄的增加，消费者饮用烈酒的比例总体上呈下降趋势，18～24岁年龄段消费者消费烈酒的比例占该人群总消费酒精饮料的22%，为各年龄阶段群体中最高。25～29岁及30～39岁消费者消费普通烈度啤酒占该人群总消费酒精饮料的27%，为各年龄层最高。具体情况见图2。

1.2 实验方法

1.2.1 风险评估流程 依据国际食品法典委员会颁布的CAC/GL-30（1999）《微生物风险评估原则和指南》，从危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述4 个方面进行定量风险评估。

危害识别、危害特征描述：通过查阅相关专著、教材、国内外文献或评估报告，收集单增李斯特菌的危害特征资料。

暴露评估是从我国生猪肉中单增李斯特菌的初始污染水平开始，以零售时最终污染水平结束，该模型分为四个模块：生肉、腌渍、发酵成熟和销售环节，每个模块的输出分布被用作下一个模块的输入或作为最终输出。考虑到金华火腿的特定制造条件（温度、pH、aw及乳酸菌数量），采用单增李斯特菌生长/不生长的简化建模方法，用于确定火腿加工和销售过程中单增李斯特菌的生长概率及生长模型，由于火腿制作过程中每个阶段的时间跨度较长故不考虑单增李斯特菌的延滞期。

风险特征描述：在危害识别、危害特征描述、暴露评估的基础上，考虑不确定性因素，确定特定人群食用含有单增李斯特菌污染的即食金华火腿切片而患李斯特菌病的概率。

1.2.2 微生物预测模型 预测微生物学模型是风险评估中有用的工具，其中预测性生长/不生长模型多次被用作风险评估工作中，供食品经营者和法规制定者用来获取有关产品中微生物生长的信息。单增李斯特菌的生长限度作为安全标准而构建的生长/不生长模型，被确证是预测食品中单增李斯特菌生长状况的良好工具[17]，本研究所涉及的模型及相关参数[3,20,31]如下所示：

其中，Π 是乘积算子；P 是生长概率；Tmin、pHmin、awmin分别是能使单增李斯特菌生长的温度、pH 和水分活度的下限值，其中Tmin=-0.4 ℃；pHmin=4.4；awmin=0.92；η是一个归一化因子（η=0.73）；NLAB是乳酸菌的种群密度（CFU/g）；NLm是单增李斯特菌的种群密度（CFU/g）；NcpdLAB是乳酸菌的临界种群密度（CFU/g），NcpdLAB=108CFU/g。

如果单增李斯特菌有生长的可能性，即当生长概率P≥0.1 时，根据发酵过程中温度、pH、aw和乳酸菌浓度估算了发酵火腿中单增李斯特菌最大生长速率（μmax），如式（2）[31]。

其中μmaxref是参考条件下的最大生长速率，μmaxref=0.181 lg CFU/（g·h）；Tref、pHref、awref分别为温度、pH 和水分活度的参考值；其中Tref=20 ℃，pHref=6.0，awref=0.99；Tmin，pHmin，awmin分别是温度、pH 和水分活度的下限值，Tmin=-0.4 ℃；pHmin=4.4；awmin=0.92；NLAB是乳酸菌的种群密度（CFU/g）；NLm是单增李斯特菌的种群密度（CFU/g）；NcpdLAB是乳酸菌的临界种群密度（CFU/g），NcpdLAB=108CFU/g。

其中，CLm表示单增李斯特菌的浓度（lg CFU/g），CLm0表示上一加工阶段单增李斯特菌的浓度（lg CFU/g），Time 表示加工阶段的时间跨度（h），aw表示加工阶段产品的水分活度，T 表示加工阶段的温度（℃）。

1.3 数据处理

应用Microsoft Excel 2016 进行数据的统计及风险特征描述，用@Risk 5.7 软件（Palisade 公司）对模型中参数进行模拟分析。风险评估模型采用拉丁超立方抽样方法进行10000 次迭代的蒙特卡洛（Monte Carlo）模拟。同时，采用Spearman 相关系数对变量与模型暴露评估结果进行敏感性分析，并据此提出合适的风险管理措施。

单增李斯特菌在生猪肉中和金华火腿生产及销售过程中的评估模型及参数如下表1。

表1 金华火腿中单增李斯特菌的风险评估模型及参数Table 1 Summary of variables and parameters used in risk assessment model of Listeria monocytogenes in Jinhua ham

2 结果与分析

2.1 危害识别

单增李斯特菌在环境中广泛存在，可以在设备表面形成生物膜，并在低温、广泛的pH、较高的盐浓度和低aw下具有一定的生存能力[46]。发酵火腿中尤其是即食火腿切片，消费者在购买该产品之后，不会进一步做热处理，并且可能会存在一定的交叉污染，导致单增李斯特菌数量上升，是人类李斯特菌病的一个潜在来源。2014 年欧盟有2161 宗李斯特菌病确诊案例[47]。2011 年至2016 年间我国的19 个省份中共报告了253 例侵袭性李斯特菌病病例，病死率为25.7%[48]。近年来世界范围内发生了多起有关发酵肉制品的单增李斯特菌病疫情，引起了社会各界广泛关注。2017～2018 年间南非暴发了有史以来最严重的一次单增李斯特菌感染事件，共确诊937 例，造成27%的死亡率，暴发来源为即食发酵香肠（polony）[49]。2014 年丹麦因食用发酵香肠和肉卷而导致了15 个死亡病例。2018～2019 年德国因食用受单增李斯特菌污染的血香肠，导致7 人死亡。2020 年世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）对有关单增李斯特菌的风险评估进行了讨论，并对单增李斯特菌的分子表征进行了重点聚焦[50]。

2.2 危害特征描述

李斯特菌病的感染症状主要表现为轻度发热，也可导致脑膜炎、中枢神经系统损害和流产。尽管2%～10%的人携带有此菌并没有任何明显的症状，但仍有潜在的风险群体容易感染李斯特菌病，包括孕妇、新生儿、老年人和免疫功能受损的成年人（如艾滋病毒患者）。在孕妇中，即使是无症状的李斯特菌病也可以传播到胎儿，导致死产、败血症和新生儿脑膜炎。孕妇在食用受单增李斯特菌污染的食物后患李斯特菌病的概率是普通人群的15～18 倍[2]。侵袭性李斯特菌感染的潜伏期可能长达90 d，这也增加了该菌与食物载体相关联的难度。目前，国际上一般认为单增李斯特菌的限量标准为2 lg CFU/g[51]。通过即食肉制品建立的指数型剂量反应模型P=1-exp（-r×D）（P 表示严重疾病的概率，D 代表单增李斯特菌的摄入数量，r 为单一细菌致病的概率。）来评估摄入即食金华火腿切片而患李斯特菌病的风险概率，其中，健康人群的r=5.34×10-14，易感人群的r=8.39×10-12[45]。

2.3 暴露评估

2.3.1 生猪肉中单增李斯特菌污染情况 通过荟萃分析的方法统计了中国24 个不同地区的新鲜猪肉中单增李斯特菌的流行率，在所分析的4446 个样本中，有540 个样本检出[11]。模拟结果如图1 所示，其90%的置信区间的污染率变化范围为-4.78～0.83 lg CFU/g，平均值为-1.90 lg CFU/g。

图1 生猪肉中单增李斯特菌污染水平分布模拟Fig.1 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes in raw pork

2.3.2 金华火腿制作过程中单增李斯特菌的生长及污染情况 根据腌制过程中的特定条件（Tsal、pHsal、awsal），通过上文中生长/不生长模型模拟得到腌制过程中单增李斯特菌的平均生长概率为0.105，腌制时期该菌生长概率的乘积算子模拟数据如图2 所示。根据生长模型得出腌制结束后火腿中单增李斯特菌的污染水平，90%的置信区间为-5.97～10.5 lg CFU/g，平均值为0.969 lg CFU/g，具体数据如图4 所示。

图2 腌制过程中单增李斯特菌生长概率的乘积算子的分布模拟Fig.2 Distribution simulation of the product operator of growth probability of Listeria monocytogenes in curing process

发酵成熟过程中单增李斯特菌的平均生长概率为0，该菌生长概率的乘积算子拟合数据如图3 所示。根据失活模型进行模拟，发酵成熟后，火腿中单增李斯特菌的平均污染水平为-0.958 lg CFU/g，具体数据如图4 所示。

图3 发酵过程中单增李斯特菌生长概率的乘积算子的分布模拟Fig.3 Distribution simulation of the product operator of growth probability of Listeria monocytogenes in fermentation process

图4 火腿制作过程中单增李斯特菌的污染水平分布模拟Fig.4 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes during ham production

2.3.3 零售过程中单增李斯特菌的生长 通过模拟单增李斯特氏菌生长/不生长的概率及生长模型，得出零售时单增李斯特菌的浓度，如图5 所示结果，90%的置信区间为-9.47～7.05 lg CFU/g，平均值为-2.59 lg CFU/g。

图5 火腿零售过程中单增李斯特菌的污染水平分布模拟Fig.5 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes during ham retail process

2.4 即食金华火腿切片风险特征描述

金华火腿中单增李斯特菌的浓度低于2 lg CFU/g的概率为78.9%，其浓度大于4 lg CFU/g 的概率为15.4%。结合剂量-反应模型，计算了在4 种不同人群每餐因摄入即食火腿切片而患李斯特菌病的概率，详见表2。考虑到每次食用的份量大小，食用即食金华火腿切片而患该病的风险概率较低。

表2 即食发酵火腿中单增李斯特菌风险预估Table 2 Risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat fermented ham

2.5 敏感性分析

通过敏感性分析评估中各个参数值与最终结果的相关性，可以找到模型中影响最终结果最重要的因素，以此确定风险控制管理的手段和措施。将相关参数一同进行敏感性分析，计算斯皮尔曼等级相关系数，得出各参数的相关系数，结果如图6。

图6 敏感性分析Fig.6 Sensitivity analysis

从图6 中可以得出，金华火腿腌制过程中水分活度对最终产品的单增李斯特菌的污染水平影响最大，其次是发酵成熟过程中的水分活度和生猪肉中单增李斯特菌的初始污染水平。腌制过程中腌制时间、pH 以及发酵成熟时的pH 对金华火腿中单增李斯特菌的污染水平影响效果有限（相关系数绝对值小于0.1）。

3 讨论

本研究初步构建了即食金华火腿切片中单增李斯特菌的风险评估模型。根据相关数据对模型的输入量进行分布拟合，模拟了从生火腿腌制、发酵成熟以及销售储藏环节中单增李斯特菌的生长可能性，腌制过程平均生长概率为0.105，发酵过程为不生长，从模拟数据可以看出，在发酵成熟过程中，火腿中单增李斯特菌的生长受到一定程度的抑制，处于失活状态。此结论与国外研究者的观测结果一致，单增李斯特菌在生产前接种至生火腿中，经过发酵成熟后的火腿中该菌呈现减少趋势[52-53]。根据敏感性分析得知，限制该菌生长的主要因素为加工过程中产品的aw。因此，对生产过程中单增李斯特菌采取控制措施时，首要考虑生产工艺中严格控制产品的aw以及减少原料肉中单增李斯特菌的浓度，同时开发出既能快速降低产品中的aw又不影响产品品质的新工艺。

FAO 和WHO 报告称，摄入每份发酵肉制品而患李斯特菌病的平均风险为2.1×10-12。Giovannini等[54]对帕尔马火腿和圣丹尼尔火腿中单增李斯特菌进行风险评估，结果表明引起食物中毒的平均概率为4.7×10-10。根据本次评估，我们得出健康成年人食用即食金华火腿切片的平均患病概率小于10-15；对于易感人群的平均患病概率小于10-13。食用即食金华火腿切片而患李斯特菌病的风险较低，金华火腿的现代加工工艺对于单增李斯特菌的控制水平可以与国际接轨。

本研究开创性的进行了金华火腿生产及销售的全过程中单增李斯特菌的暴露评估，并对即食金华火腿切片进行了风险评估，为发酵火腿中食源性致病菌的风险评估提供了参考模型。对于国内其他类型的发酵火腿，加工工艺及原料选择与金华火腿可能会有差异，导致火腿理化性质存在不同，这也加重了发酵火腿风险评估的难度以及微生物食品安全控制的复杂性，因此需要加强研究人员对发酵火腿中食源性致病菌的重视。微生物本身的特点决定了微生物风险评估的复杂性，模型每一个环节都存在变异性和不确定性。目前我国食品微生物定量风险评估处于快速发展阶段，评估过程中如：模型参数的不确定性、加工过程中环境条件的不稳定性、微生物自身的异质性和在食品基质的理化性质不断变化的过程中微生物抗逆性及活性的改变，导致本次评估模型具有一定的不确定性。数据方面：消费模型中，由于我国对于居民每餐中食品细分品类的膳食量调查较为缺乏，本次研究采用是膳食指南中即食食品的摄入量，以上模型及参数虽能一定程度模拟金华火腿中单增李斯特菌的暴露值，仍无法准确进行替代。此外本评估未考虑到制作过程中及消费者购买产品后可能造成的交叉污染，对评估结果可能会造成一定的影响。

此外国家应加强单增李斯特菌的监管系统，检测不同食品中该菌的暴露情况，并汇总统计由单增李斯特菌而引起的相关疾病的数据；通过分析不同来源单增李斯特菌的分子分型，使该菌与相关食品或疾病建立起有效联系，实现精准防控。企业及政府部门要对发酵火腿的生产车间及生产原料进行严格的管控和监督；加工设备定期清洗消毒并定期检测单增李斯特菌的污染状况；对不符合加工生产的设备要进行及时更换和维修，卫生条件不合格的工厂要进行及时整治，防止制作过程中设备及生产环境对产品造成污染。同时销售过程中商家要遵守即食肉制品的规章制度，对刀具、称量工具等设备进行清洗杀菌，避免后期交叉污染。