裸燕麦麸皮提取物和低频脉冲刺激干预PFD 大鼠对ArfGAP3 通路的影响

李碧慧，王悦棠，刘完美，时欢，徐赛群，何娴婕

（长沙医学院，湖南长沙 410219）

盆底功能障碍（PFD）系盆底肌肉、筋膜、韧带损 伤而引发的盆腔脏器移位或机能减退，其典型表现为尿失禁、排尿困难、排便障碍等，临床现有不同疗法相关报道效果不一[1]。PFD 疾病初始病位在于脾肾，而病机则与肾气不固、脾胃虚弱、中气下陷密切相关，基于此机制有研究尝试应用裸燕麦麸皮提取物进行调理，取得了较为理想的效果。低频脉冲刺激作为近年来常见的物理疗法，旨在通过刺激病灶局部特定的肌肉群，从而逐步恢复肌肉力量[2]。既有相关研究对上述两种疗法干预PFD 的效果均予以确认，但尚未相关研究对两种疗法进行比较研究，本文对其进行对照实验研究可补充相关理论[3-4]。

1 材料与方法

1.1 研究动物

2022 年10—12 月，对30 只成功造模的Wistar品系PFD 疾病大鼠进行研究，实验动物均由湖南省动物实验中心提供（SPF 级），饲养在恒湿55%±5%、（22±2）℃的环境中，保持昼夜节律，动物自由摄食和饮水。

1.2 仪器与试剂

UV-9000S 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HH-4 恒温水浴锅，无锡玛瑞特科技有限公司；BX-Y2426 离心沉淀机，北信未来物联技术有限公司；JNT-DC 大小鼠体重秤，北京冀诺泰科技发展有限公司；P36 生物刺激反馈仪，武汉康贝诺医疗设备有限公司。

裸燕麦麸皮，河北省张北县燕北绿色保健食品厂；氢氧化钠（1310-73-2UN），试剂纯，天津鹏坤化工有限公司；盐酸（H44020344），试剂纯，合肥旭日化工有限公司；考马斯亮蓝试剂（6104-58-1），试剂纯，长沙艾碧维生物科技有限公司；石油醚（8032-32-4），试剂纯，南京巨吉石化有限责任公司。

1.3 造模方法

参照《大鼠慢性肌筋膜疼痛触发点的电生理和病理组织学研究》所用方法对大鼠造模，即触摸钝性打击点肌肉有明显的紧张带，在紧张带上寻找膨大结节，用电极插入膨大结节内能引发局部抽搐反应[5]。

1.4 干预方法

将成功造模的30 只PFD 大鼠均分为3 组，模型组不予其他干预，药物干预组和物理干预组的干预周期均为15 d。

（1）药物干预组（裸燕麦麸皮提取物灌胃）：裸燕麦麸皮经碾磨、筛分、烘干、脱脂等处理，而后经过滤、真空浓缩、低温沉淀、真空干燥等操作获得裸燕麦苷。建立裸燕麦苷-甲醇标准液（5 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL）的标准曲线，以溶剂为空白对照，于561 nm 处测吸光值。得到裸燕麦苷标准曲线方程为y=0.300 7x+0.001 5。按照大鼠体重调整为100 μg/kg 剂量用于灌胃处理，灌胃频率1 次/d[6]。

（2）物理干预组（低频脉冲刺激）：用生物反馈电刺激疗法对PFD 大鼠激痛点进行干预，1 次/2 d，每次10 min。

1.5 数据采集

干预结束后颈椎脱臼法处死大鼠，取盆底病灶（耻尾肌周围区域）组织研磨后高速离心（3 000 r/min），加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，用酶联免疫吸附法测定蛋白质浓度，IPP 软件分析各条带灰度值。检测指标包括ArfGAP3、透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）、层粘连蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型胶原蛋白（TypeⅣ collagen，Ⅳ-C）含量。

1.6 统计分析

用SPSS 20.0 分析，计量资料（±s）组间比较采用F/t检验，HA、LN、Ⅳ-C 和ArfGAP3 含量的关联用回归模型分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同组别蛋白含量的比较

不同组别PFD 大鼠的ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C含量的差异均有统计学意义（P＜0.05），两两比较结果见表1。说明裸燕麦麸皮提取物灌胃及低频脉冲刺激均能激活模型大鼠病灶局部的ArfGAP3 信号通路，猜测干预后的PFD 大鼠其局部卫星细胞所介导的信号传递有所增强，对应由多种分子参与的网络级联反应将开启并加速病灶肌肉的损伤修复。药物干预组和物理干预组PFD 大鼠盆底组织中ArfGAP3、HA、Ⅳ-C 含量均高于模型组，而LN 含量均低于模型组。其中HA 作为酸性粘多糖，具有多种特性及重要的生理作用，其高水平表达不仅有利于组织再生，还有助于局部炎症反应作用的发挥。同时，HA 还将嵌入筋膜组织内部，从而有效增强邻近肌肉结缔组织的滑动能力，继而减小局部病灶肌肉组织的继发损伤程度。非胶原性结构蛋白LN 作为基底膜核心成分，其含量改变一般与肝脏纤维化改变相关。

表1 不同组别大鼠ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C 含量的比较（±s，mg/L）

表1 不同组别大鼠ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C 含量的比较（±s，mg/L）

注：a 表示药物干预组与模型组差异显著（P ＜0.05）；b 表示物理干预组与模型组差异显著（P ＜0.05）；c 表示物理干预组与药物干预组差异显著（P ＜0.05）。

组别 ArfGAP3 HA LN Ⅳ-C模型组（n=10） 67.41±4.96 15.57±1.59 55.70±4.05 7.99±1.08药物干预组（n=10） 74.09±5.81a 18.74±1.44a 20.41±1.30a 11.40±1.19a物理干预组（n=10） 94.65±7.19bc 24.74±3.05bc 18.42±1.55bc 19.34±2.31bc

2.2 物理干预组蛋白含量的回归分析

基于表1 研究结果，选择干预效果较为显著的物理干预组大鼠进行进一步分析。数据显示，以病灶组织中ArfGAP3 含量为因变量，以HA、LN、Ⅳ-C 含量为自变量，拟合的回归方程（ArfGAP3 含量=1.45+0.41×HA 含量+0.50×LN 含量+0.89×IV-C 含量）有统计学意义（P＜0.05）。HA、LN 和Ⅳ-C 对因变量的影响程度（OR值）分别为5.77、6.16 和4.66，说明ArfGAP3 信号通路激活后相应ArfGAP3 蛋白表达有所增加，同时会不同程度影响病灶局部HA、LN、Ⅳ-C 含量，因此通过相关常用指标监测也可评估或预测不同干预措施的效果。

3 讨论与结论

PFD 的发生机制包括神经肌肉损伤、基质组分改变、信号网络级联激活等，无论何种机制，均与细胞内内质网、高尔基体物质转运相关信号分子存在一定关联，因此越来越多基础研究将关注重点转移至信号分子蛋白，ArfGAP3 成为近年来的研究热点。基于上述研究结果，本课题组猜测LN 同样参与了PFD 模型大鼠病灶的修复过程，具体机制或原因尚需后续深入探究。细胞外间质基底膜中Ⅳ-C 含量的增加在维持肌肉弹性的同时，能快速增加肌肉量，继而可能降低局部疼痛感并提升病患阻力训练的效果。除此之外，物理干预组PFD 大鼠Ⅳ-C 蛋白含量的高水平表达间接证实其干预措施对原发病灶的修复效果更佳，低频脉冲刺激能更有效地将构建肌肉的肌原纤维传递至整个肌肉纤维，从而保持病灶局部肌肉群较好发挥正常功能[5]。

综上可知，低频脉冲刺激和裸燕麦麸皮提取物虽然均能对PFD 大鼠病灶局部ArfGAP3 通路产生激活作用，但低频脉冲刺激物理治疗方式能更为快捷且显著地降低LN 蛋白表达，增加HA、Ⅳ-C 蛋白表达，可能对病灶局部肌功能恢复有更好促进作用。