虎耳草科虎耳草属石荷叶组叶下表皮斑点的形态学研究

陈永成，陈涵，周倩彤，张卓欣*

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东广州 510630；2.中国科学院华南植物园，广东广州 510630）

石荷叶组（sect.IrregularesHaworth）属于虎耳草科（Saxifragaceae）虎耳草属（SaxifragaL.），现组内有18 种[1-2]，广泛分布于东亚地区，以中国和日本为主要分布区域[3]。石荷叶组植物均为多年生直立草本；掌状叶基生，具长柄，叶肉内多具碳酸钙结晶体，叶背具紫红色斑点或无；聚伞花序圆锥状，花两侧对称[3-5]。其在形态上颇为独特，是广受欢迎的园艺植物，也常作为中草药使用[6-9]。虎耳草（S. stolonifera）别名石荷叶，喜生于阴暗潮湿处，其叶中含有岩白菜素、槲皮甙、槲皮素和没食子酸等活性物质，具有治疗中耳炎、缓解牙痛、解热排毒、抑菌消炎等功效，是历史上沿用已久的中草药材[10-15]。但民间供药并不严格按照可药用种类，药材种类因地而异，存在用药普遍却难以鉴别的问题，特别是虎耳草一类可全草入药的广布中药材，在中药材炮制过程中丢失部分植物体生活特征，更加难以区分。

HARA 在《Nova Flora Japonica》中详细记录了5种日本产物种，包括8 变种、4 变型[16]。根据《中国植物志》第34 卷记载，石荷叶组植物在中国有7 种及3 变种[5]。在《Flora of China》第8 卷中，我国的石荷叶组物种修订为7 种及4 变种[3]。石荷叶组虽然仅是虎耳草属中的一个较小类群，但是作为虎耳草属内唯一拥有两侧对称花的类群，对于研究整个虎耳草属起源、演化历史及形态分类方面具有重大意义。但自石荷叶组划分以来，石荷叶组内种的数目和划分一直存在较多争议。潘锦堂用叶背具紫红色或褐色斑点作为蒙自虎耳草（S. mengtzeana）的主要分类特征[3,5]。但虎耳草（S. stolonifera）、大桥虎耳草（S. daqiaoensis）、卵心叶虎耳草（S. epiphylla）及一些新发表的种也具有叶背面斑点[1-2,4]，而石荷叶组叶片背面斑点的形态性状、解剖结构及性状分布却未见有进一步的研究论述。叶背面斑点具有作为石荷叶组种间分类依据的潜力，并可能具有一定的生物学意义。

因此，本研究通过对虎耳草属石荷叶组的叶表皮斑点形态和解剖结构等形态学研究，对组内种类的斑点特征进行统计分析，为虎耳草属的形态学分类研究、中药材鉴定提供一定的理论依据与指导。

1 材料与方法

1.1 材料来源

为了验证叶背面具斑点是虎耳草属石荷叶组在虎耳草科中特有的一种形态特征，本研究的取样范围扩大到狭义虎耳草科。实验材料为虎耳草科植物叶片16 种、3 变种、1 变型，其中亭阁草属（MicranthesHaworth）植物2 种、金腰属（ChrysospleniumTourn.ex L.）1 种、峨屏草属（TanakaeaFranch. & Sav.）1 种、虎耳草属山羊臭组（Saxifragasect.CiliataeHaworth）植物5 种和1 变种、虎耳草属石荷叶组（Saxifragasect.IrregularesHaworth）植物7 种和2 变种、1 变型，具体见表1。叶片取材自腊叶标本和野外采集的活体材料，均保存在广州市华南农业大学林学与风景园林学院植物标本馆（CANT）中。

表1 实验材料表

1.2 试剂与仪器

番红，分析纯，福州飞净生物科技有限公司；石蜡，化学纯，德国Leica 公司；无水乙醇，分析纯，广州市政欣化工科技有限公司；二甲苯，分析纯，广州嘉乐化工有限公司；固绿染色液，分析纯，福州飞净生物科技有限公司；FAA 固定液，实验纯，兰杰柯科技有限公司；树胶，显微镜用级别，上海国药集团化学试剂有限公司；明胶，分析纯，江苏亚泰化工有限公司；甲醛，分析纯，蚌埠市精诚化工有限责任公司；50%戊二醛，分析纯，西安天茂化工有限公司。

RM2235切片机、EM AMW 组织处理仪、EP CPD300 临界点干燥器、EM ACE600 真空镀膜仪、M165C 体视镜，德国Leica 公司；BX43 普通光学显微镜，日本Olympus 公司；EVO MA15 扫描电子显微镜，德国Zeiss 公司。

1.3 实验方法

为了清晰、多角度地观察叶背斑点的表皮及解剖结构，实验采用徒手切片法、石蜡切片法和叶表皮常规染色制片法，使用体视镜、普通光学显微镜和扫描电子显微镜用于观察。

对所采集标本进行整理分类后，使用体视显微镜（10×10）对虎耳草属石荷叶组各种类进行叶表皮斑点形态观察及显微影像拍摄。取新鲜样本叶片，在原有方法基础上使用改良的徒手切片法观察叶片斑点纵切面的结构和颜色[17]。采用石蜡切片法对新鲜叶片的斑点解剖结构进行观察。实验采用叶表皮常规染色制片法观察叶表皮特征[18]。撕取叶上表皮（腹面）和叶下表皮（背面）组织染色制片后在光学显微镜下观察、拍照并测量，之后玻片封边保存。为了更好地观察斑点的表皮结果，本研究使用扫描电子显微镜观察叶表皮微形态[19]。

1.4 数据分析

通过ImageJ-win 64 对所得各标本影像内的斑点数量、大小及密度等指标进行测量，分析时采取统一视野范围，像素大小为2 448×1 920。测量斑点数量时，仅将视野范围内完整斑点视为有效斑点进行记录，边缘斑点不计入总数；斑点大小通过测量图片内所有斑点面积后取其平均值参与后续数理统计分析过程；斑点密度为1 mm2内的斑点个数（ind）。

获取实验所需叶表皮相关基础形态指标后，所有数据均使用SPSS 25.0 软件进行方差分析，采用Duncan’s 多重比较方法。

2 结果与分析

2.1 叶斑点形态结构

使用体视镜、常规染色制片法和扫描电子显微镜观察叶腹面和背面表皮细胞发现，在有叶背斑点的石荷叶组植物中，无论斑点是什么颜色，斑点内均有聚集成群的气孔（图1C、E）；斑点处表皮细胞明显小于斑点外表皮细胞（图1B、E、F、H）。除黑蕊虎耳草、灯架虎耳草、波密虎耳草和青藏虎耳草在叶片上表皮的气孔有分布外，其余观察种在上表皮均无气孔（表2）。

图1 石荷叶组叶背面斑点解剖结构

表2 叶斑点与气孔性状分布

通过徒手切片及石蜡切片观察斑点解剖结构发现，斑点下存在一个较大的气孔下穴结构（气室），可能是斑点上面的气孔群聚在一起而产生；伴有大小不一的晶体聚集在气室上部，叶背面紫色斑点的色素集中在表皮细胞层，斑点处细胞较小（图1A）。

2.2 叶斑点性状分布

在石荷叶组中，大桥虎耳草（S. dapiaoensis）、卵心叶虎耳草（S. epiphylla）、蒙自虎耳草（S.mengtzeana）、龙胜虎耳草（S. kwangsiensis）、虎耳草（S. stolonifera）和日本虎耳草（S. nipponica）有斑点结构，而镜叶虎耳草（S. fortuneivar.koraiensis）、红毛虎耳草（S. rufescens）、扇叶虎耳草（S. rufescensvar.flabellifolia）和其他虎耳草科已观察植物则没有斑点结构（表2）。斑点形态为近椭圆或不规则形；斑点颜色多样，主要有淡黄色、淡紫色或紫色、白色、淡褐色。斑点颜色在个体水平会发生变化，其中虎耳草同一个体或居群有多种颜色的斑点，因此单独进行数据分析。斑点区域较叶表水平面有凸起、凹陷、平整三种类型（表2）。

根据石荷叶组具有斑点各种类之间斑点密度差异，对石荷叶组具有斑点的种类进行对比（表3）。斑点密度以蒙自虎耳草最小，平均密度为（0.37±0.17） ind/mm2；虎耳草最大，平均密度为（1.88±0.24） ind/mm2；虎耳草叶片上斑点密度显著大于蒙自虎耳草（P＜0.05），为蒙自虎耳草斑点平均密度的5.08 倍。

表3 虎耳草属石荷叶组斑点大小与斑点密度

根据斑点大小及斑点密度差异，将具有斑点特征的石荷叶组各种类进行对比（表2，表3）。由表3 可知，6 种具有斑点特征的石荷叶组种类（大桥虎耳草、瓣萼虎耳草、虎耳草、卵心叶虎耳草、蒙自虎耳草、日本虎耳草）在斑点大小这一特征上具有明显差异。其中，瓣萼虎耳草最小，平均面积为（0.12±0.01） mm2；蒙自虎耳草最大，平均面积为（0.70±0.30） mm2，其斑点显著大于瓣萼虎耳草（P＜0.05），为萼瓣虎耳草斑点平均面积的5.83 倍。

单独对所采集到的虎耳草属石荷叶组中虎耳草标本上新老叶片的斑点大小及斑点密度特征进行对比分析（表3），发现新叶与老叶在斑点大小与斑点密度上具有显著差异。其中，虎耳草新叶上的斑点大小为0.17 mm2，老叶上斑点大小为0.27 mm2，可知新叶斑点大小显著小于老叶（P＜0.05）；在斑点密度方面，新叶斑点密度为2.56 ind/mm2，老叶上斑点密度为1.01 ind/mm2，新叶斑点密度显著大于老叶（P＜0.05）。在同一虎耳草个体中，新叶叶片上斑点颜色呈现出明显的紫红色，而老叶上斑点颜色则趋于暗淡，呈淡红色或淡绿色。

2.3 气孔结构特征

观察虎耳草科18 种植物的气孔长轴取向，其中龙胜虎耳草、扇叶虎耳草、虎耳草、灯架虎耳草、波密虎耳草、山地虎耳草、青藏虎耳草、苍山虎耳草、峨屏草均为统一朝向，其余均为无规则（表2）。所观察的虎耳草科植物的气孔外形除波密虎耳草的气孔器为圆形外，其余均为椭圆形（表2，图1G）。

根据DILCHER 对植物气孔器排列类型的定义，无规则型气孔复合体的描述为保卫细胞周围的邻近细胞和一般的表皮细胞无差异；平列型为两个副卫细胞完全围绕着保卫细胞，其长轴与保卫细胞的长轴平行[20-21]。据此，本文观察的石荷叶组气孔复合体类型是平列型（图1D、G）。

3 讨论与结论

3.1 叶下表皮斑点的形态特异性

虎耳草叶片解剖图像（图1A、B）表明斑点下存在一个由气孔复合成气孔群产生的较大气室，这可能是叶表皮斑点凹凸不平的原因。特别是在干燥标本上，一般可以观察到凹入的斑点，可能是叶表皮干燥变形后陷入气室导致，说明斑点凹凸情况必须要使用新鲜叶片进行观察。在鲜叶上，有的叶片斑点对比下表皮表现为较浅的绿色，也可能是复合的气孔下穴内有气体和聚集的晶体，导致反射的光线更多，使斑点颜色泛白。

而紫色或红色斑点是由表皮细胞中的色素积累形成的（图1A）。在同一种虎耳草中，斑点颜色也呈现出不同的颜色，这可能与叶片采摘时间、标本保存环境（温度、保存时间）及叶片叶龄有关[22-26]。

虎耳草新叶上斑点显著小于老叶，而新叶斑点密度则显著大于老叶，可能与叶片年龄有关，即随着叶龄的增大，斑点也随之增大，进而导致单位面积内虎耳草叶片上斑点密度降低[26-27]。

在本研究中，斑点中的气孔复合体以DILCHER叶表皮特征体系和王宇飞对该体系的翻译中的术语称为平列型气孔器[20-21]，在其他虎耳草科及相关物种的叶表皮研究中，该类型被认为是无规则型[28-31]。本研究结合SEM 和叶表皮染色制片方法，可以更加清晰地观察到细胞的界限，因此可以观察到两个平行于气孔的副卫细胞，与前人研究结果不同。王慧等[28]认为由于虎耳草的气孔复合体在斑点内，而斑点外面表皮细胞较大，以往对气孔器术语在定义虎耳草类群时值得商榷。因此，后续可以进行表皮细胞发生观察，以了解气孔复合体分化顺序。

3.2 叶下表面斑点的分类学意义

本研究发现，8 种虎耳草属石荷叶组植物中，只有红毛虎耳草和镜叶虎耳草没有叶下表皮斑点，因此《中国植物志》用斑点区分蒙自虎耳草的论点应进行修订[5]。同时，斑点特征（表2、3）有明显的种间特性，可用于石荷叶的组下分类和物种划分。

本研究对虎耳草属石荷叶组具有斑点结构种类的种间斑点大小关系进行比较得知，石荷叶组种间斑点大小存在显著差异。除红毛虎耳草与镜叶虎耳草无斑点外，石荷叶组各种类间斑点从大到小依次为蒙自虎耳草>大桥虎耳草>卵心叶虎耳草>虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草。其中，蒙自虎耳草的斑点大小为0.70 mm2，显著大于同组其他种类虎耳草；瓣萼虎耳草斑点大小为0.12 mm2，显著小于同组其他种类。故斑点大小可以作为虎耳草属石荷叶组中部分种类（如蒙自虎耳草及瓣萼虎耳草）的分类特征。而石荷叶组各种类间斑点大小可能与其种类自身特性及其生存环境有关，具体机制还需进一步研究。

石荷叶组具有斑点结构植物种间斑点密度从大到小依次为虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草＞卵心叶虎耳草>大桥虎耳草>蒙自虎耳草。其中，虎耳草叶表皮斑点密度最大，为1.88 ind/mm2，显著大于实验所测得石荷叶组其余种类；蒙自虎耳草斑点密度最小，为0.37 ind/mm2，其密度与除虎耳草以外该研究内石荷叶组其他种类无显著差异。在本研究中，斑点密度特征仅可用作区别虎耳草与蒙自虎耳草的分类特征。

以上所述斑点特征均可以用于虎耳草与近缘种的园艺种和中药材鉴定。

3.3 斑点与气孔群的生物学意义

多数蛾蝶类昆虫倾向于在健康叶片上产卵，从而为后代提供更好的生存环境。部分植物能够通过改变叶片部位的形态来抵御有害昆虫的侵害，如生长于厄瓜多尔的一种彩叶芋（Caladium steudneriifolium）能够通过在叶子上产生白色斑纹来模拟病株和虫害后的形态，以避免害虫的啃噬侵害[32]。石荷叶组具有斑点种类可能也通过类似的机制进化出叶表面斑点结构，从而躲避昆虫侵害，避免叶片受到损伤，但后续需要进一步的生理学研究验证该推测。

植物气孔的分布受环境影响较大，一般来说，气孔密度会随着环境中水分减少而增加，气孔面积会随着环境中水分减少而呈现小型化发展[33-35]。气孔分布面积小而密集能使其在适应不同类型气候时具有更高的灵活性和更广的适应范围，而气孔群符合上述植物为适应环境变化所需的气孔分布类型要求[36]。因此，本研究推测气孔群作为虎耳草属石荷叶组的独特性状，可能是使得石荷叶组植物既能够在低海拔潮湿凉爽的半阴生环境中有较好的长势，也能够在高山、高海拔地区中生存的重要因素之一。