黄芪四君子汤调节T细胞PD1泛素化水平重塑肿瘤免疫微环境抑制胃癌增殖的研究

谭倩影,谢贵萍,李响,刘莲芳,吴冠楠,吴晓宇,翟競,

(1.南京中医药大学第一临床医学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学附属张家港中医院,江苏 苏州 320582;3.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院消化系肿瘤外科,江苏 南京 210029)

胃癌是起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,其发生机制主要是在胃黏膜的组织更新和损伤修复过程中,成体细胞出现异常分化[1],机体免疫系统无法正常识别,异形细胞持续增殖分化,形成肿瘤细胞[2]。因此,如何调节机体免疫系统,使其能够识别并抑制肿瘤生长,是目前胃癌治疗的研究焦点。

大量研究表明,传统中医药在调节机体免疫功能方面具有显著疗效[3-5]。国医大师周仲瑛教授认为“癌毒”核心病机为脏腑功能失调,正气不足、热毒壅塞。正气亏损,癌毒损伤,脾胃运化无权,气血乏源,胃络失养,致瘀毒积聚,终而形成癌瘤。因此,如何扶正固本,培补中土,以胃气为本,使药气四达,周身之机运流通,瘀毒自散,是追本溯源、治本之策。胃癌患者脾胃功能虚弱,运化乏力;胃癌治疗在“扶正固本”的基础上,多强调“益气健脾”。黄芪四君子汤从益气健脾名方四君子汤加用黄芪而来。现代药理学研究进一步表明,黄芪四君子汤主要的靶标蛋白集中于细胞因子(如IL-6、IL-8、IL-1β、EGF)、上皮间质转化(如MAPK1/3/8、MMP9、STAT3、AKT1)、血管新生(如VEGFA、VEGFR)和肿瘤发生发展相关信号通路的关键蛋白(如ERBB2、MYC、JUN)等[6]。我们前期的临床研究也表明,黄芪四君子汤可通过调节细胞因子IL-8的表达从而提高胃癌患者的整体预后[7]。因此,进一步研究黄芪四君子汤对胃癌免疫微环境改变的机制,具有重大意义。

本研究建立MFC胃癌皮下荷瘤小鼠模型,以黄芪四君子汤灌胃进行干预,通过观察小鼠体质量、肿瘤大小、外周血中常见细胞因子的含量以及肿瘤组织、脾脏组织、胸腺组织中各类T细胞亚群的表达量和肿瘤组织中T细胞内PD1泛素化水平,考察黄芪四君子汤对胃癌组织增殖以及小鼠本身免疫功能的影响,以期为黄芪四君子汤治疗胃恶性肿瘤提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物与分组

C57BL/6小鼠24只,雄性,SPF级,6～8周龄,体质量20～22 g,购于北京斯贝福实验动物公司,生产许可证号:SCXK(京)2014-0006。动物分笼饲养,自由进食、饮水,室温为20～25 ℃,动物适应性饲养1周后用于实验。本实验已通过南京中医药大学附属医院实验动物研究伦理,伦理批号:2020DW-22-02。

1.2 药品制备

黄芪四君子汤由黄芪15 g,人参9 g,炒白术9 g,茯苓9 g,炙甘草6 g加入10倍量的水煎煮1 h,煎煮2次,纱布滤过,浓缩至含生药量0.129 g·mL-1,分装,高温消毒后置于4 ℃冰箱保存备用。

鼠源性胃癌细胞株MFC(上海裕信生物);IFN-γ、IL-2、TNF-α ELISA试剂盒(ExCell Bio,22B265、22B287、22B272)和IL-8 ELISA试剂盒(欣博盛生物,M221024-104a);CD3+(Biolegend,b16669);CD4+(FITC标记)和CD8+(PE标记)抗体(Biolegend,480039、480007);PD1抗体(Cell Signaling,84651);泛素化(PD1)抗体(Cell Signaling,3936S);蛋白A+G琼脂糖(Protein A+G Agarose,Pierce,20421)。

1.3 仪器

高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号:LegendMicro 21R);酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司,型号:AMR-100);荧光分子成像系统(上海弘基电脑有限公司,型号:C500×);电泳仪(美国Bio-Rad公司,型号:Mini-PROTEAN Tetra);荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号:QuantStudio3);流式细胞仪(美国Bechman Coulter公司,型号:Navios)。

2 方法

2.1 小鼠胃癌模型的建立、分组及给药方式

采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在常规条件(37 ℃、饱和湿度、5%CO2)下培养MFC胃癌细胞至对数生长期,调整细胞密度为1×107mL-1。C57BL/6小鼠右侧腋下经75%乙醇消毒后,接种0.2 mL MFC细胞悬液,建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型。将小鼠随机分为空白对照组,模型组,中药高、低剂量组,每组6只。建模后第7天给药,给药前记录小鼠体质量及肿瘤大小。根据黄芪四君子汤临床用量计算出小鼠等效剂量是6.24 g·kg-1,此剂量作为低剂量,将低剂量的2倍12.48 g·kg-1作为高剂量,中药高、低剂量组灌胃黄芪四君子汤。空白对照组及模型组给予等量生理盐水灌胃。每日1次,给药10 d,第10天处死小鼠。每3 d及处死前记录小鼠体质量及肿瘤大小。

2.2 外周血IFN-γ、IL-2、IL-8和TNF-α水平检测

眼眶静脉丛采血法分离小鼠血液,取100 μL离心分离血清;按照ELISA试剂盒说明书中的操作指南,检测IFN-γ、IL-2、IL-8和TNF-α水平。

2.3 肿瘤、脾、胸组织腺淋巴细胞亚群检测

将新鲜组织置于冰PBS中,经剪碎、离心、消化后,过70目筛网并研磨,离心后重悬细胞,转移至新的EP管中,调整浓度为2×106mL-1。分别加入适量的CD4+、CD8+、PD-1抗体,混匀充分后于避光条件下放置15 min。再加100 μL红细胞裂解液,继续放置10 min;补PBS 1 mL,离心后弃上清液。用500 μL PBS重悬沉淀,于流式细胞仪中检测。

2.4 免疫组化法检测肿瘤组织中PD1的表达水平

应用经福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肿瘤组织标本,选择组织大小合适,肿瘤组织丰富的蜡块。用切片机连切4 μm厚片,在52～55 ℃水温中展片,待烘干后对切片进行脱蜡(顶部10 s,底部1 min),去离子水清洗。加入PD1抗体、苏木精复染,去离子水清洗。最后组织脱水,透明,封片。切片观察和结果判读。

采用半定量评分:①根据细胞染色强度计分:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;②根据细胞百分比计分:阳性细胞率<5%为0分,5%～50%为1分,51%～75%为2分,>75%为3分。将2项结果相加计分,评估PD1表达水平。

2.5 免疫共沉淀

将已分组好的肿瘤组织单细胞悬液(制备方式同前)加入适量NP40裂解液,超声粉碎,冰上裂解30 min后,在离心机上以12 000 r·min-1低温离心20 min,吸取上清,移入干净离心管内,加入Protein A+G Agarose,置于4 ℃下封闭2 h,避免非特异性结合蛋白。以12 000 r·min-1低温离心10 min,吸取上清,加入PD1抗体孵育过夜,IgG中加入等量同源IgG,4 ℃下孵育过夜。第2天,加入Protein A+G Agarose,置于4 ℃下孵育4 h以捕捉抗原-抗体复合物。低温再次离心,弃去上清并保留沉淀,添加NP40蛋白洗脱液后离心,重复1次。加入上样缓冲液,将蛋白煮沸变性,进行Western blot检测。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 黄芪四君子汤对MFC胃癌荷瘤小鼠体质量及肿瘤生长情况影响

空白对照组小鼠呈自然生长。给药前,各组小鼠体质量无明显差异(P>0.05)。第6、9、10天时,与空白对照组相比,模型组小鼠由于肿瘤迅速生长,体质量明显上升(P<0.05);与模型组比较,中药高、低剂量组小鼠体质量呈下降趋势,在第6、9、10天时,黄芪四君子汤高剂量组小鼠体质量明显低于模型组(P<0.05)(图1)。

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,

在记录肿瘤生长情况时,我们发现随着黄芪四君子汤给药剂量的增高,其肿瘤大小明显降低。与模型组相比,在第6天时,中药低、高剂量组肿瘤大小均明显降低(P<0.05,P<0.01),而在第9、10天时,仅中药高剂量组降低显著(P<0.05),中药低剂量组则有所下降但无统计学差异(图2)。

注:与模型组比较,

3.2 黄芪四君子汤对MFC胃癌荷瘤小鼠免疫微环境的影响

3.2.1 黄芪四君子汤对MFC胃癌荷瘤小鼠细胞因子表达的影响 通过检测各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-8的表达水平,我们发现,与空白对照组相比,模型组小鼠的IL-8明显上升(P<0.05),而IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明显下降(P<0.001)。与模型组比较,中药高剂量组小鼠血清IFN-γ、IL-2和TNF-α水平明显增加(P<0.01,P<0.001),IL-8的表达水平明显降低(P<0.05)。见图3。这表明黄芪四君子汤可促进MFC胃癌荷瘤小鼠产生细胞因子,形成抗肿瘤免疫微环境,而细胞因子IL-8则可能对肿瘤的免疫起抑制作用[8]。

注:与空白对照组比较,#P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。±s,n=6。

3.2.2 黄芪四君子汤对MFC胃癌荷瘤小鼠肿瘤、脾脏、胸腺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞以及PD1+T细胞表达的影响 流式检测证实,随着黄芪四君子汤剂量的增加,MFC荷瘤小鼠的肿瘤组织、脾脏组织以及胸腺组织中的CD4+T细胞以及CD8+T细胞的比例明显高于模型组(P<0.001),提示肿瘤微环境中的主要抗肿瘤效应细胞T细胞表达增加(图4～5)。进一步检测T细胞表面抑制性分子PD1结果提示,与模型组相比较,高、低剂量黄芪四君子汤组可以降低PD1表达(P<0.001)(图6)。

注:A.肿瘤组织;B.脾脏组织;C.胸腺组织;与模型组比较,***P<0.001。=6。

注:A.肿瘤组织;B.脾脏组织;C.胸腺组织;与模型组比较,***P<0.001。=6。

注:A.肿瘤组织;B.脾脏组织;C.胸腺组织;与模型组比较,***P<0.001。=6。

3.2.3 免疫组化检测黄芪四君子汤对MFC胃癌荷瘤小鼠PD1表达的影响 与模型组相比,黄芪四君子汤高剂量组小鼠肿瘤组织中PD1的表达明显降低,其组化评分也明显降低(P<0.01)(图7)。

注:与模型组比较,

3.3 黄芪四君子汤通过CD8+T细胞中泛素化水平对PD1分子表达的影响

为了进一步明确黄芪四君子汤影响PD1分子表达水平的机制,我们根据Meng[9]的研究结果,推测PD1分子胞浆内Lys233位点可与FBXO38(E3泛素连接酶)结合,使PD1受体泛素化,表面分子出现降解,是PD1表达降低的机制之一,而黄芪四君子汤则可能通过促使PD1受体泛素化,增强了这一过程。因此,我们检测了实验小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞PD1泛素化水平,结果提示:与模型组相比,中药高、低剂量组CD8+T细胞的PD1泛素化水平明显高于模型组(P<0.01)(图8)。

注:与模型组比较,

4 讨论

胃癌的发生发展除了肿瘤细胞本身的基因突变以外,也与所在机体的免疫环境改变有关[2]。肿瘤所处的免疫微环境和肿瘤细胞的共同作用导致肿瘤细胞出现了免疫逃逸,原本能够杀伤肿瘤细胞的免疫细胞出现了功能异常,从而导致肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移[10]。免疫细胞特别是各类T细胞在肿瘤的发生发展中起了关键作用[11]。T细胞作为抗肿瘤免疫应答的主要效应细胞,通过识别肿瘤细胞抑制肿瘤进展,发挥免疫监视和细胞毒性的作用。但在肿瘤微环境中的T细胞大多数处于免疫抑制状态,表现为Treg细胞表达上调;T细胞表面抑制性受体表达,造成T细胞功能衰竭等[12]。目前研究表明,LAG3、TIM3、CTLA4以及PD-1是标志性的T细胞功能衰竭的表面受体[13],其中PD1抑制剂在临床运用中已获得确切的疗效[14]。免疫治疗通过阻断肿瘤细胞和免疫细胞之间的作用靶点,使得效应细胞可以正常识别、杀伤肿瘤细胞,从而达到抑制肿瘤生长的目的[15]。因此,免疫治疗是继传统的化疗、放疗和靶向治疗外又一新的治疗方向[16]。

传统医学认为,肿瘤的产生是从无形之邪发展到有形实邪的过程,癌毒病机理论认为正气的亏虚是肿瘤产生的先决条件。脾胃亏虚,无力御邪,加之运化失常,邪毒蕴结,促进胃癌的发生发展。因此,黄芪四君子汤通过“扶正固本”“益气和胃”,从机体本源出发,强调“以补为攻”,为改变自身微环境,从而抑制胃癌细胞增殖,提供了有利的理论依据。

我们前期研究黄芪四君子汤的作用机制提示其与肿瘤微环境中IL-8的表达相关[7],同时网络药理学的结果也提示免疫微环境是其作用的靶点之一[6,17]。本实验表明,黄芪四君子汤高剂量组外周血IL-2、IFN-γ、TNF-α的表达也明显高于模型组(P<0.01,P<0.001),IL-8的表达水平明显下降(P<0.05),提示黄芪四君子汤可能通过改变肿瘤免疫微环境抑制肿瘤增殖。为了明确黄芪四君子汤的免疫作用靶点,我们收集小鼠的肿瘤、脾脏、胸腺组织制备单细胞悬液进行流式检测T细胞亚群,结果提示模型组肿瘤组织中的CD4+T细胞和CD8+T细胞表达水平明显低于低、高剂量中药组(P<0.001),而PD1的表达量则相反(P<0.001)。由此可以推论,黄芪四君子汤可以提高CD4+T细胞和CD8+T细胞的表达,但引起肿瘤免疫逃逸的关键免疫检查点PD1+T细胞的亚群出现明显的下降。考虑PD1泛素化是影响PD1表达的重要机制[9],我们进一步进行PD1的泛素化检测,其结果提示,低、高剂量中药组PD1泛素化水平高于模型组(P<0.01),黄芪四君子汤可能促进了这个过程的发生,从而增强降解过程,使PD1表达降低。在实验过程中我们发现,模型组小鼠肿瘤大小与体质量相比较空白组明显上升,且有统计学差异(P<0.05)。黄芪四君子汤组小鼠肿瘤大小相较于模型组有所下降,且高、低剂量组在第6天时具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。但在第9、10天时黄芪四君子汤低剂量组小鼠的肿瘤大小虽然有下降趋势,但无统计学意义,而同时收集的肿瘤组织进行流式检测和泛素化检测时均有统计学意义。由此我们推测,黄芪四君子汤对小鼠免疫环境的改变是持续并呈剂量依赖型的,但其对肿瘤的抑制作用则存在“窗口期”,因此,选择合适的用药时期和用药浓度,并进一步探索潜在的机制,是后续的研究方向。

综上所述,黄芪四君子汤是在经典名方四君子汤基础上,增加传统益气药黄芪配伍而成,益气健脾之效更甚,通过“扶正祛邪”,激发脏腑经气,促进瘀毒自散。其分子机制在于黄芪四君子汤可能通过促进T细胞内泛素化连接酶的表达/活化,从而促进PD1泛素化,使表面分子PD1降解,T细胞免疫检查点重新激活,发挥自身免疫监视及清除功能,抑制肿瘤细胞增殖,控制肿瘤进展。然而,本实验仅有小鼠在体实验,为了进一步验证以上结论,在后续实验中,我们将会挖掘黄芪四君子汤的有效单体,设计体外细胞实验。