肉苁蓉葡萄酒酿造关键工艺及其体外抗氧化活性

宋晶晶，姜蕾，侯吉超，吴斌，吕泽，张剑林，夏娜*

（1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844006；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；3.新疆理工学院食品科学与工程学院，新疆 阿克苏 843000）

管花肉苁蓉为列当科管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎，现代研究表明，人工管花肉苁蓉含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木脂素类、多糖类、生物碱类等多种生物活性物质，具有增强免疫力、抗疲劳、抗衰老、通便、保肝、壮阳及益智等功效[1-4]，可用于临床治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症[5]。管花肉苁蓉天然生长于半荒漠和荒漠地区，具有极强的抗旱、抗寒、耐盐碱特性，主要分布在新疆、甘肃、内蒙古等地，因其功效显著、长于沙漠被美誉为“沙漠人参”[6-8]。近年肉苁蓉成为治理荒漠的伴生产物，对肉苁蓉产业化起到极大的促进作用。红柳和梭梭树，作为肉苁蓉寄主植物，促进了肉苁蓉的人工种植产业的发展，同时，延长了产业加工链、拓宽了经济附带产业，经济价值显著提高。

我国作为世界上葡萄种植及葡萄酒生产大国，整体产业呈现稳步上升的趋势[9]。目前，我国葡萄种植面积为1 275 万hm2，占全球总面积的11.16%[10-11]。新疆具有悠久的葡萄栽培历史和得天独厚的气候条件，2019 年，葡萄栽培面积逐渐扩大到14.33 万hm2，产量270 万t；葡萄干产量25.2 t，占我国产量95%以上[12-13]。新疆的葡萄市场处于供过于求的状态，鲜食葡萄没有稳定的销售渠道，致使葡萄大量堆积，造成极大浪费的同时导致了直接的经济损失。

随着我国经济发展，人们的健康保健意识也逐渐增强，开始对养生较为关注，同时，饮食方式也发生了巨大改变，一些功能性食品兴起，功能性酒也应运而生，并占据了一定的市场[14-15]。本研究旨在将新疆特色植物肉苁蓉与鲜食葡萄木纳格两种植物原料中加入专一酵母菌株，经过特定的微生物代谢途径能使原料中的营养物质更好地保存，并能提高浸提液中的可溶性固形物的提取率，从而提高产品中有效功能性成分的含量，同时转化为更易被人体吸收、利用的产物[16-18]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

管花肉苁蓉、木纳格葡萄：市售；酵母菌：喀什大学微生物实验室。

1.2 仪器与设备

LE2002E/02 电子天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；MJX-160-Z 霉菌培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50KB 型立式蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；SXKW 数显控温电热套：北京市永光明医疗仪器厂；RE-52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；LB32T LB-90T 手持糖度仪：迈德施（上海）分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程：

1.3.2 肉苁蓉水提物的制备

参考葛继红等[19]的提取方法稍作改动，选取品质紧致、色泽淡黄、无变质的干肉苁蓉。将干肉苁蓉粉碎过20 目筛网，将肉苁蓉颗粒与蒸馏水按1∶10（g/mL）的比例提取5 h，在沸水浴条件下回流提取2 次，过100 目滤网，抽滤，浓缩备用。

1.3.3 葡萄汁的制备

去除霉烂及成熟度不一致的葡萄鲜果，分选后，除梗、破碎，经压榨取汁，低温（4 ℃）贮藏，备用。

1.3.4 肉苁蓉葡萄酒的发酵工艺

按一定比例接入酵母菌进行发酵，置于恒温培养箱中发酵，待发酵液的残糖量降至4 g/L 时，发酵结束[20]；取上清液，4 000 r/min 条件下离心10 min 后，85 ℃杀菌30 min，得到肉苁蓉葡萄酒。

1.3.5 肉苁蓉葡萄酒单因素试验设计

量取200 mL 原料（肉苁蓉∶葡萄汁）质量比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 的肉苁蓉葡萄发酵原液于洁净的锥形瓶中，考察酵母菌接种量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、发酵温度（18、20、22、24、26 ℃）、发酵时间（4、5、6、7、8 d）对发酵结束后测定酒精度及感官评分的影响，重复3 次平行试验。

1.3.6 肉苁蓉葡萄发酵液响应面优化试验

以肉苁蓉葡萄酒的酒精度（Y1）及感官评分（Y2）为响应值，选取对肉苁蓉葡萄酒影响较大的3 个因素，酵母接种量（A）、发酵温度（B）、原料质量比（C）为考察因素，利用响应面软件Design-Expert.V8.0.6 进行响应面优化试验设计。响应面的试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 基本指标的测定

1.3.7.1 理化指标

酒精度、干浸出物、总酸、挥发酸、二氧化硫采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法检测[21]，可溶性固形物采用手持糖度仪测定，pH值采用酸度计测定。

1.3.7.2 微生物指标

菌落总数按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》规定方法进行测定；大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》规定方法进行测定。

1.3.8 肉苁蓉葡萄酒的感官评定

由15 名完成《葡萄酒品尝学》课程的食品专业人员经培训组成感官评定小组，分别对肉苁蓉葡萄酒的外观、色泽、香气、滋味4 个指标进行感官评价，所有指标分为优、良、中、差4 个等级。要求身体健康且对酒精无过敏性症状人员作为感官评定组成员，样品评鉴完成后用清水漱口，3 min 后评鉴下一个样品[22]，具体评分标准见表2。

表2 肉苁蓉葡萄酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation cniteria of Cistanche deserticola wine

1.3.9 体外抗氧化活性测定

1.3.9.1 DPPH 自由基清除能力的测定

DPPH 自由基清除能力的测定参照杨冰鑫等[23]的方法，略作改动。DPPH 自由基清除率计算公式如下。

X=（A0-Ai+Aj）/A0×100

式中：X 为DPPH 自由基清除率，%；A0为空白组的吸光度；Ai为样品溶液的吸光度；Aj为无水乙醇代替DPPH 溶液时测得对应浓度的吸光度。

1.3.9.2 ABTS+自由基清除能力的测定

ABTS+自由基清除能力的测定参考秦晋颖等[24]的方法，略作改动。ABTS+自由基清除率计算公式如下。

Y=（A0-Ai）/A0×100

式中：Y 为ABTS+自由基清除率，%；A0为ABTS 溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度；Ai为待测溶液与ABTS 溶液混合液的吸光度。

1.3.9.3 ·OH 清除能力的测定

·OH 清除能力的测定参照Luo 等[25]的方法，略作改动。·OH 清除率计算公式如下。

Z=（A0-A1+A2）/A0×100

式中：Z 为·OH 清除率，%；A1为37 ℃下反应30 min 后在波长510 nm 处的吸光度；A0为蒸馏水替代样品为空白对照在510 nm 处的吸光度；A2为蒸馏水替代水杨酸在510 nm 处的吸光度。

1.3.9.4 铁离子还原能力的测定

参照Kilani 等[26]的测定方法，略作改动，制备铁离子还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）工作液，于37 ℃恒温水浴锅中贮藏备用。分别取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mL 肉苁蓉葡萄酒于试管中，用纯水补充至2 mL，取稀释好的肉苁蓉葡萄酒6 μL，加入预热至37 ℃的FRAP 工作液180 μL、超纯水18 μL，避光精确反应5 min，酶标仪测定593 nm 处的吸光度，以双蒸水为空白对照。

1.4 数据处理

试验数据通过Origin 85 以及Design-Expert.V8.0.6软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 酵母菌接种量对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响

酵母菌接种量对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响如图1 所示。

图1 酵母菌接种量对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响Fig.1 Effect of yeast inoculum on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由图1 可知，当酵母菌接种量较少时，肉苁蓉葡萄酒中的糖不能完全被酵母菌利用转化，故酒精度较低；当酵母菌接种量较大时，酵母菌会大量生长繁殖消耗发酵液中的糖，用于生成酒精的底物量减少[27]。因此，酵母菌接种量为0.08%时较为合适。

2.1.2 发酵温度对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响

发酵温度对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响如图2 所示。

图2 发酵温度对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由图2 可知，随发酵温度升高，微生物新陈代谢越来越旺盛，会较早出现疲劳现象而停止发酵，此后，微生物代谢降低，酒精度随着发酵温度的不断升高呈先上升后下降趋势，而较低的温度会使发酵速度减缓，使得发酵时间变长，发酵较为彻底[28]。当温度达到24 ℃时，酒精度最高，但没有达到最佳口感。因此，选择发酵温度为22 ℃进行后续试验。

2.1.3 原料质量比肉苁蓉葡萄酒对酒精度及感官评分的影响

原料质量比对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响如图3 所示。

图3 原料质量比对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响Fig.3 Effect of raw-material ratio on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由图3 可知，肉苁蓉葡萄酒的原料质量比为1∶5时，酵母自身代谢最快，使得发酵液中糖转化为酒精的速度最快，酒精度最高，随着肉苁蓉比例的增加，发酵液中糖含量升高，可能对发酵过程产生消极的影响愈明显。当原料质量比为1∶4 时，感官评分达到最大值，因此，选择原料质量比1∶4 进行后续试验。

2.1.4 发酵时间对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响

发酵时间对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响如图4 所示。

图4 发酵时间对肉苁蓉葡萄酒酒精度及感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Cistanche deserticola wine

由图4 可知，当发酵时间较短时，导致发酵不彻底，糖没有被酵母充分利用，导致酒体寡淡；当发酵时间过长时，虽发酵彻底，酒精度较高，但口感偏酸，并伴有苦味，还因进入酵母衰亡期使其自溶，致肉苁蓉葡萄酒口感偏差。因此，发酵时间为7 d 时最合适。

2.2 肉苁蓉葡萄酒发酵条件的优化

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验的结果，综合考虑选取以酵母菌接种量（A）、发酵温度（B）、原料质量比（C）为自变量，以肉苁蓉葡萄酒的酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，进行三因素三水平试验，结果如表3～表5 所示。

表3 肉苁蓉葡萄酒发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Experimental design and analysis of response surface in fermentation conditions of Cistanche deserticola wine

根据肉苁蓉葡萄酒响应面试验进行多元回归方程拟合，建立以肉苁蓉葡萄酒酒精度和感官评分为评价指标的拟合方程：酒精度Y1= 5.64+0.13A+0.18B+0.22C+0.050AB+0.043AC-0.033BC-0.039A2-0.074B2-0.13C2；感官评分Y2=92.20+1.13A+2.13B+4.25C+1.50AB+0.25AC-0.25BC-4.10A2-2.10B2-4.35C2。

由表4、表5 可知，肉苁蓉葡萄酒酒精度与感官评分模型回归方程的相关系数分别为R2=0.991 8、R2=0.984 6，调整复相关系数分别为R2Adj=0.981 3、R2Adj=0.964 8。2 个多元回归模型P 值＜0.01，说明模型极显著；多元回归模型的失拟项P 值＞0.05，说明无失拟因素存在，对模型是有利的。以酒精度为响应值时，模型中A、B、C、B2、C2影响极显著（P＜0.01），A2和交互项AB、AC 影响显著（P＜0.05），由F 检验可以得到因子贡献率为C＞B＞A，即3 个因素对肉苁蓉葡萄酒酒精度的影响主次顺序为C（原料质量比）＞B（发酵温度）＞A（接种量）。以感官评分为响应值时，模型中B、C、A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），A 和交互项AB 影响显著（P＜0.05），由F 检验可以得到因子贡献率为C＞B＞A，即3 个因素对肉苁蓉葡萄酒感官评分的影响主次顺序为C（原料质量比）＞B（发酵温度）＞A（接种量）。

表4 以肉苁蓉葡萄酒酒精度为评价指标响应面试验结果的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test based on the alcohol content of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

表5 以肉苁蓉葡萄酒感官评分为评价指标响应面试验结果的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface test based on the sensory score of Cistanche deserticola wine as an evaluation index

根据肉苁蓉葡萄酒感官评分回归方程得出不同因子的响应面分析图，结果见图5。

图5 各因素交互作用响应面图Fig.5 Response surface of factor interaction

由图5 可知，在Y1模型中因素A 与因素B 之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，即因素A 与因素B 之间的交互作用对肉苁蓉葡萄酒酒精度的影响最大。在Y2模型中因素A与B 之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，即因素A 与B 之间其交互作用对肉苁蓉葡萄酒酒精度的影响最大。

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果为酵母接种量0.06%、发酵温度25.96 ℃、原料质量比1∶4.12。此优化条件下发酵后的肉苁蓉葡萄酒酒精度预测值为5.603%vol，感官评分预测值为93.24。为验证试验结果的真实性，考虑实际的操作情况，将发酵工艺参数调整为酵母添加量0.06%、发酵温度26 ℃、原料质量比1∶4，在此发酵工艺条件下，进行3 次验证试验，肉苁蓉葡萄酒的酒精度实际值为5.60%vol，感官评分实际值为93，结果与预测值相差甚微，证明该回归模型可靠。

2.2.2 基本指标的测定

在最优发酵工艺条件下制备的肉苁蓉葡萄酒的酒精度为5.60% vol，干浸出物29.64 g/L，总酸6.82 g/L（以酒石酸计），总糖35.72 g/L（以葡萄糖计），大肠菌群≤3 MPN/100 mL，菌落总数≤50 cfu/mL，均符合国家标准的要求。

2.2.3 肉苁蓉葡萄酒的抗氧化活性

肉苁蓉葡萄酒的抗氧化活性检测结果见表6。

表6 肉苁蓉葡萄酒的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of Cistanche deserticola wine

由表6 可知，肉苁蓉葡萄酒对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率及还原能力分别为96.53%、95.64%、96.86%及97.39，有较好的自由基清除能力且有一定的还原能力。许多果实中因含有多酚类物质而表现出抗氧化活性[29]，肉苁蓉中含有苯乙醇苷类或环烯醚萜苷类、木质素类和多糖类物质，此类物质成分具有一定的抗氧化活性[30]。何梦梦等[31]的研究表明，肉苁蓉水提物中含有较高浓度的多酚类物质，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。综上，肉苁蓉葡萄酒具有一定的抗氧化活性。

3 结论

采用单因素试验与响应面设计分析得出肉苁蓉葡萄酒发酵的最优工艺为酵母菌接种量0.06%、发酵温度26 ℃、原料质量比1∶4，此条件下得到的酒味清香、肉苁蓉与葡萄酒气味均衡，口感纯正、酒香愉悦，酒精度5.60%vol，感官评分93。抗氧化活性分析结果表明，其还原能力发酵前后有一定的变化，发酵后的肉苁蓉葡萄酒DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率优于发酵前的肉苁蓉与葡萄汁混合物，肉苁蓉葡萄酒具有一定的抗氧化作用。肉苁蓉葡萄酒的研制丰富了新疆葡萄酒品类，为新疆特色植物肉苁蓉复合酒的产业化奠定基础。