微小核糖核酸34a与沉默信息调节因子1在宫颈癌组织中的表达及相关性研究

陈 庆,李乙航,赵金燕,吴晓玲,谢秀英

(1.西安交通大学第二附属医院,陕西 西安 710004;2.长春生物制品研究所有限责任公司,吉林 长春 130012)

宫颈癌是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤,也是导致发展中国家女性肿瘤死亡的首要原因[1]。近年来,宫颈癌的发病呈现年轻化趋势,是女性健康的重大威胁。虽然高危HPV感染导致宫颈癌发生已经被证实[2],然而,宫颈癌发生的具体机制尚未阐述清楚。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度约为18～22个核苷酸的非编码RNA,通过与特定基因的3’-UTR区结合,抑制相应mRNA的翻译[3]。据估计,miRNA控制了大约30%的蛋白质编码基因组[4]。近年来的研究[5]表明,miRNA在许多生物学过程中发挥着重要作用,例如细胞增殖、分化、发育、代谢。miRNA的异常表达或改变与许多人类疾病相关,包括心血管疾病、眼部疾病、炎症和癌症等[6]。微小核糖核酸34a(miR-34a)是miR-34家族的重要成员,近来发现其在肿瘤进展中发挥重要作用,可影响肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等[7]。沉默信息调节因子1 (Silent information regulator 1,SIRT1)是一种保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶,在细胞凋亡、细胞衰老、炎症和肿瘤发生中起着至关重要的作用[8]。已有研究报道SIRT1可通过促进去乙酰化及catenin的核转位促进宫颈癌发展[9]。然而,目前SIRT1和miR-34a在宫颈癌进展中的关系尚未完全阐明。本研究旨在探索miR-34a及SIRT1在宫颈癌中的表达及其相互关系,以期为宫颈癌的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2016 年 1 月至 2017 年 12 月于本院住院治疗的宫颈癌患者 50 例为研究对象,同期因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者30例作为对照组。50例宫颈癌患者年龄28～75岁,病例纳入标准:符合宫颈癌诊断标准,且经病理检查确诊为宫颈鳞状细胞癌或腺癌;术前无放化疗治疗;无精神异常及交流障碍。排除标准:既往患有其他恶性肿瘤;术前接受放化疗或免疫治疗;伴有严重心、肝、肾等脏器功能不全;临床资料不完整。患者对本研究知情并签署知情同意书,本研究获得西安交通大学第二附属医院医学伦理委员会批准(No.2016077)。

1.2 主要试剂与仪器 SIRT-1兔抗人单克隆抗体(bs-2257R)购自北京博奥森生物技术公司,免疫组化试剂盒(PV-6001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司, Trizol(15596-026)购自美国Invitrogen公司;miRNA荧光定量检测试剂盒购自Applied Biosystems公司;荧光定量PCR仪(美国ABI公司);OLYM-PUS显微镜(日本OLYMPUS 公司)。

1.3 RT-qPCR检测miR34a表达 采用Trizol提取总RNA,随后将RNA逆转录为cDNA。使用 Taq Man miRNA检测试剂盒检测 miR-34a表达,以U6作为内源性对照,操作步骤严格按照说明书进行。反应条件为:95 ℃ 预变性 10 min,95 ℃ 变性15 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃ 延 伸 30 s,总共进行40个循环。采用 2-ΔΔCt法计算 miR-34a 相对表达水平。引物序列如下:miR-34a 上游引物5’-GGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3’,miR-34a下游引物5’-CCCGTTGGCAGTGTCTTAGCT-3’;U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,U6 下游引物5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 免疫组化检测SIRT1蛋白表达 福尔马林固定,石蜡包埋,组织切片(厚度4 μm),二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中抗原热修复2 min。3%过氧化氢封闭10 min,SIRT1一抗(1∶150), 4 ℃ 过夜,PBS洗涤,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗涤,DAB 显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性结果判断:随机观察5个视野,将阳性细胞百分率分为5个等级,分别评分为:<5%为0;5%～25%为1;25%～50%为2;50%～75%为3;>75%为4。按染色强度分为4个等级,分别评分为:阴性,背景色相同或不染色为0;弱,染色呈淡黄色为1;中,染色呈黄或棕黄色为2;强,染色呈黄褐色为3。 最终评分按下列公式计算:免疫反应评分(IRS) =阳性细胞百分率评分×染色强度评分,评分>3为阳性。

2 结 果

2.1 miR-34a在宫颈癌组织中的表达 RT-qPCR检测显示,与正常宫颈组织(1.00±0.27)相比较,miR-34a在宫颈癌组织(0.52±0.21)中的相对表达水平明显降低(P<0.01)。根据miR-34a在宫颈癌组织表达的均值(0.52),分为高miR-34a表达组(40例)和低miR-34a表达组(10例)。对miR-34a表达和宫颈癌患者的临床病理特征进行相关分析,见表1。结果表明,miR-34a的表达与患者年龄、淋巴转移以及病理类型无相关性(均P>0.05);而与FIGO分期、肿瘤分化程度呈显著相关(均P<0.05)。

表1 miR-34a 表达与宫颈癌患者临床病例特征的关系[例(%)]

2.2 SIRT1在宫颈癌组织中的表达 免疫组化结果显示,SIRT1在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织。半定量分析显示,SIRT1免疫反应评分在宫颈癌组织(7.1±2.37)与正常宫颈组织(4.1±1.61)比较中存在统计学差异(P<0.05)。SIRT1在宫颈癌及正常宫颈组织中的阳性率分别为84%和20%,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A:正常宫颈组织阴性表达; B:正常宫颈组织阳性表达;C:宫颈癌组织阴性表达;D:宫颈癌组织阳性表达

2.3 SIRT1在宫颈癌组织中的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 SIRT1蛋白在宫颈癌组织中的表达水平与宫颈癌分化程度显著相关(均P<0.05),与患者年龄、宫颈癌FIGO分型、淋巴结转移以及病理类型无相关性(均P>0.05),见表2。

表2 SIRT1 表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 宫颈癌组织中miR-34a与SIRT1表达的相关性 Spearman相关分析显示,宫颈癌组织中miR-34a与SIRT1表达呈显著负相关(r=-0.327,P<0.05),见表3。

表3 宫颈癌组织中miR-34a 与SIRT1表达的相关性[例(%)]

3 讨 论

根据世界卫生组织的数据,宫颈癌是女性第四大常见癌症。2018年在全球范围内,大约有57万例女性被诊断出宫颈癌,其中约有31.1万例女性死于这种疾病。与发达国家相比,宫颈癌在发展中国家更为常见,宫颈癌仍是女性健康的巨大威胁。目前宫颈癌的发病机制尚未完全阐明,因此,积极探索宫颈癌的病理机制,对于寻找宫颈癌新的临床治疗靶点和改善预后具有重要意义。

最近的研究表明,miRNA可能是HPV相关癌症发生和发展的标志物,有研究已证实miRNA和HPV癌蛋白之间的相互作用。此外,基因芯片研究还发现几种miRNA在宫颈组织中的表达。有些miRNA是上调的,如miR-21、miR-24和miR-155,而有些miRNA是下调的,如miR-100、miR-145等。近年来,有研究[10-11]报道,miR-34在一些不同类型的肿瘤中是下调或失活的,如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌及肺癌等。本研究发现miR-34a在宫颈癌的表达明显低于对照组,这证实了以前关于miR-34a在宫颈癌中呈低表达的相关研究[12]。也提示miR-34a在宫颈癌发展中可能具有重要作用。

miR-34a 定位于染色体1p36.23,是肿瘤抑制的关键调节因子,参与肿瘤的发生与发展[13]。如:Luo等[14]报道miR-34a可通过靶向promimin1抑制喉癌细胞的增殖;Jiang 等[15]发现miR-34a通过下调CDC25A表达抑制宫颈癌的生长及转移;Xu等[16]发现miR-34a在黑色素瘤组织是下调的,并可通过靶向ZEB1抑制黑色素瘤细胞及黑色素移植瘤的生长。miR-34a参与宫颈癌的发生、发展,可能是宫颈癌预后的新型标记物。通过将宫颈癌患者分为miR-34a高表达及低表达两个亚组发现,miR34a表达与宫颈癌FIGO分期及肿瘤分化程度显著相关,而与患者年龄、淋巴转移及病理类型无显著相关,这表明miR-34a表达与肿瘤进展密切相关。

SIRTl属于烟酰胺(NAD+)依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirtuins家族,人类SIRTl基因位于10q22.1,长约33 kb,蛋白质分子量约为60 kD,具有NAD依赖的脱乙酰基酶活性[17]。大量研究已经证实SIRT1在肿瘤形成过程扮演重要角色,SIRTl在许多肿瘤中出现异常表达,例如乳腺癌[18]、宫颈癌[19]、胃癌[20]、肝细胞癌[21]等。SIRT1影响肿瘤细胞的凋亡、增殖、转移、侵袭等生物学特性;研究[22]发现,在宫颈癌中SIRT1是高表达的,干扰SIRT1的表达可导致宫颈癌细胞增殖抑制和凋亡增加。本研究还发现,SIRTl在宫颈癌组织中呈高表达,SIRT1在宫颈癌中的阳性率明显高于正常宫颈组织,这也与以前的研究相一致[23]。并且SIRT1表达与宫颈癌分化程度密切相关,表明SIRT1可能在宫颈癌的发展中起重要作用。进一步的相关性分析显示,SIRT1和miR-34a在宫颈癌组织中的表达呈负相关,这提示在宫颈癌发展中miR-34a与SIRT1可能相互作用。Mirtarbase预测显示SIRT1可能是miR-34a的靶基因,这进一步提示,miR-34a可能通过靶向SIRT1在宫颈癌发展中发挥作用[24]。

SIRT1在肿瘤的发展中起关键作用,Deng 等[25]发现在胃癌中miRNA-34a通过靶向SIRT1调控胃癌细胞的增殖和凋亡,在胃癌进展中发挥关键作用。另一方面,miR-34a表达与高危型HPV感染有关,有报道表明miR-34a在高危HPV (HR-HPV)感染组织中表达明显降低[26]。miR-34a是p53的下游靶点,在宫颈癌发生中,HPV-E6癌蛋白结合p53后,通过泛素依赖的蛋白酶体系统靶向其降解[27]。p53的失活导致可用来结合miR-34启动子区域的蛋白数量减少,进而导致miR-34a在大多数HPV感染组织中的表达下调。

综上所述,本研究结果表明miR-34a在宫颈癌组织中呈低表达,SIRT1在宫颈癌中高表达,两者表达水平呈负相关。这为宫颈癌的临床治疗提供了一个潜在的分子靶点。然而,本研究也有一些局限,例如:本研究纳入病例较少,需纳入多中心研究进一步扩大样本量。其次,本研究未对miR-34a在宫颈癌中的作用机制进行深入探索。下一步,我们除进一步扩大样本量外,还打算对miR-34a在宫颈癌中的抑癌机制进行深入研究。