妊娠期糖尿病视网膜病变患者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p表达水平及检测临床意义

李威威,杨 倩,常 瑚,宋 森,李世强,程亚辉,岳 钟,冯 丽,肖博文

(1.保定市第一中心医院眼科,河北 保定071000;2.天津市北辰医院眼科,天津 300134)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是指女性在妊娠期间首次发生糖代谢紊乱的疾病,常有多饮、多食、多尿等症状,严重影响妊娠结局,可引发流产、难产、严重胰岛素抵抗、羊水过多、酮症酸中毒、胎儿畸形、胎儿生长受限、新生儿呼吸窘迫、新生儿低血糖等并发症[1-2]。妊娠期出现了糖尿病,也会引发视网膜的疾病,GDM患者血糖控制不达标会对孕妇的心脏、大脑、肾、视网膜血管等造成不利影响。糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是目前常见的受妊娠影响的严重微血管疾病,常有视力下降、视物模糊、辨色能力降低、眼部疼痛等表现,严重时可引发孕妇失明,对妊娠结局产生不利影响[3]。因此及时对妊娠期女性DR进行诊断和干预治疗对于降低妊娠不良结局、提高优生优育质量具有重要意义。已有多项研究报道DR患者血清中微小RNA(miRNA)水平的变化与疾病的进展有关,并被认为可作为相关疾病(包括GDM)的生物标志物。miR-200c-3p是 miR-200家族的成员,可能通过调节转录后翻译参与调节DR进展,研究显示miR-200c-3p可能会加剧DR的发展,抑制miR-200c-3p可减轻DR中的焦亡[4]。另外,已有研究显示miR-200c-3p的水平变化对妊娠结局和妊娠进展具有功能重要性[5]。miR-20b-5p在糖尿病视网膜病变大鼠上调,miR-20b-5p的过表达可以促进内皮细胞的增殖,并抑制其凋亡[6]。然而关于miR-200c-3p、miR-20b-5p在妊娠期DR患者中的表达水平尚不明确,因此本文通过测定miR-200c-3p、miR-20b-5p 在妊娠期DR患者中的表达水平探究两者的临床价值,为临床治疗妊娠期DR提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019年1月至2021年1月在本院收治的GDM患者155例,年龄25～34岁,平均(29.28±2.68)岁,根据其是否伴有DR分为GDM组(80例)和DR组(75例)。同期选取95例正常妊娠期女性为对照组,年龄24～35岁,平均(29.01±3.10)岁。病例纳入标准:所有患者符合《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)》中的诊断标准[7];单胎;孕检资料完整,依从性良好;能较好的配合各项检查,认知能力正常。排除标准:伴有妊娠高血压、自身免疫性疾病、感染性疾病、甲状腺疾病、多囊卵巢综合征等;有自然流产史、习惯性流产史;非正常受孕,近期使用糖皮质激素类药物;其他原因引起的眼部疾病等。根据视网膜病变程度进行分组[8]:Ⅰ期:出现视网膜微动脉瘤或视网膜小出血点;Ⅱ期:视网膜出血或出现黄色硬性渗出;Ⅲ期:视网膜白色棉絮状软性渗出;Ⅳ期:有颞侧显微组织增生,不完全性视网膜脱离,黄斑、血管弓受牵引;Ⅴ期:完全视网膜脱离。Ⅰ期为轻度DR组(30例),Ⅱ、Ⅲ期为中度DR组(26例),Ⅳ、Ⅴ期为重度DR组(19例)。本研究经医院道德伦理委员会批准通过,所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 检测方法 血糖检测仪(型号POCT)购于杭州艾康;全自动生化分析仪(型号DXC800)购于贝克库尔曼;糖化血红蛋白分析仪(型号H50)购于深圳迈瑞。采集所有受试者空腹外周静脉血、餐后2 h静脉血5 ml,室温静置20 min后,3000 r/min离心10 min,收集血清,采用血糖检测仪对受试者空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)进行测定。用全自动生化分析仪测定受试者低密度脂胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)。采用RT-qPCR法检测血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平,RNA提取试剂盒提取血清组织RNA,将一定量RNA反转录为cDNA。采用定量PCR仪对miR-200c-3p、miR-20b-5p进行扩增。反应条件:95 ℃、90 s,95 ℃、30 s,63 ℃、30 s,72 ℃、15 s;40个循环。miR-200c-3p、miR-20b-5p与内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

表1 三组受试者一般资料比较

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 观察项目 所有DR妊娠女性患者均进行相同治疗,对所有患者进行随访,以出院日为随访起点,记录患者发生预后不良事件的发生情况,随访截至胎儿出生。预后不良包括孕妇妊高征、胎儿畸形、胎儿发育迟缓、新生儿视网膜出血等。根据随访结果分为预后良好组和预后不良组。

2 结 果

2.1 三组受试者一般资料比较 见表1。三组受试者年龄、体重指数(BMI)比较无统计学意义(均P>0.05);与对照组相比,GDM组、DR组患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05);与GDM组相比,DR组患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05)。

2.2 不同严重程度DR患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平比较 见表2。与轻度DR组相比,中度、重度DR组患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05);与中度DR组相比,重度DR组患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05)。

表2 不同严重程度DR患者miR-200c-3p、miR-20b-5p 水平比较

2.3 预后良好组、预后不良组DR患者一般资料比较 见表3。预后良好与预后不良DR患者年龄、BMI比较无统计学意义(均P>0.05);与预后良好组相比,预后不良组DR患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05)。

表3 预后良好组、预后不良组DR患者一般资料比较

2.4 DR患者不良预后危险因素Logistic回归分析 见表4。将DR患者是否发生预后不良为因变量,以年龄、BMI、FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示血清miR-200c-3p高水平、miR-20b-5p高水平为DR患者发生预后不良的危险因素(均P<0.05)。

表4 DR患者不良预后危险因素Logistic回归分析

2.5 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平对DR患者预后不良的诊断价值 见表5(图1)。ROC曲线结果显示,血清miR-200c-3p表达水平诊断DR患者不良预后曲线下面积(AUC)为0.927(95%CI:0.843～0.974),敏感性为77.78%,特异性为91.67%,截断值为2.74%;miR-20b-5p水平诊断DR患者不良预后AUC为0.848(95%CI:0.746～0.920),敏感性为92.59%,特异性为64.58%,截断值为2.43;两者联合检测显著提高对DR患者不良预后的诊断价值,AUC为0.985(95%CI:0.924～0.999),敏感性为92.59%,特异性为95.83%。两者联合对DR患者不良预后的AUC显著大于血清miR-200c-3p单独诊断的AUC(Z=2.364,P=0.018)和miR-20b-5p单独诊断的AUC(Z=2.779,P=0.006)。

图1 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平对DR患者预后不良诊断价值的ROC曲线

表5 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平对DR患者预后不良的诊断价值

3 讨 论

GDM是指女性妊娠前糖代谢正常,妊娠期首次出现的糖耐量异常的一种代谢性疾病,是女性妊娠期常出现的合并症之一,严重影响孕妇及胎儿的生命健康,随着人们饮食习惯的改变、居住环境的变化,GDM患病率呈现逐渐升高的趋势,虽然多数的GDM患者在妊娠后会逐渐恢复正常,但患2型糖尿病的概率会大大增加[9-10]。DR是糖尿病常见的严重微血管并发症,是妊娠期女性视力减退的重要因素,而妊娠期间心血管系统、免疫系统、代谢系统等的变化又会加剧DR病情的进展,最终导致孕妇视力下降、视物模糊、失明、胎儿生长受限、胎儿窘迫、胎儿视网膜出血等不良表现[11-13]。因此探究与妊娠期DR病情密切相关的新生生物学因子对于缓解孕妇病情、降低不良事件的发生等方面具有积极意义。

研究显示,糖尿病患者血清中促炎细胞因子IL-8、TNF-α水平升高,而miR-200c-3p是一种炎症相关的miRNA,其可参与炎性细胞因子的积累[14-15]。在糖尿病引起的视网膜病变中,机体的免疫炎症反应和新生血管的形成之间存在密切的关系,研究证实,在DR中免疫炎症反应是促进病理性新生血管的关键因子[16]。Li等[4]也研究显示高糖诱导的人视网膜微内皮细胞中miR-200c-3p水平明显升高,且升高miR-200c-3p水平可能会加剧DR的进展,而抑制miR-200c-3p可减轻DR中的炎性反应。高志强等[17]也研究发现miR-200c-3p在糖尿病并发症患者血清中明显升高,且其表达水平与疾病发展相关,患者中晚期miR-200c-3p水平明显高于早期。本研究结果显示,妊娠期DR及GDM患者血清中miR-200c-3p水平显著高于正常妊娠者,其中妊娠期DR患者血清中miR-200c-3p水平显著高于GDM患者,随着DR病情的加深,miR-200c-3p水平呈现升高的趋势,与Li等[4]研究结果基本一致。在长期高血糖状态下,miR-200c-3p水平逐渐升高,由于miR-200c-3p具有促炎作用,引发体内炎症因子大量积累,致使病理性新生血管生成,导致视网膜结构破坏,加剧视网膜病变。另外,本研究Logistic回归分析结果显示血清miR-200c-3p水平升高是妊娠期DR患者预后不良的危险因素,并对妊娠期DR患者的不良预后具有一定的诊断价值。

miR-20b-5p是一种血管内皮生长因子(VEGF)诱导的miRNA,已经证实其在调节细胞增殖、分化、凋亡和血管生成方面具有重要作用[18]。研究显示,VEGF是DR发生的重要因素,其破坏血-视网膜屏障(BRB)的内皮细胞之间的紧密连接,增加视网膜血管内皮细胞增殖和迁移,加速新血管生成从而诱导视网膜微血管功能障碍,促进视网膜病变[19]。另外,也有研究显示,上调miR-20b-5p会降低紧密连接蛋白表达,增加BRB的通透性和微血管渗漏,导致糖尿病视网膜损伤[20]。本研究结果显示,妊娠期DR及GDM患者尿液中miR-20b-5p 水平显著高于正常妊娠者,其中妊娠期DR患者尿液中miR-20b-5p 水平显著高于糖尿病患者,随着DR病情的加深,miR-20b-5p 呈现升高的趋势,这一结果与Zhu等[20]研究结果一致。Logistic回归分析结果显示尿液中miR-20b-5p 水平升高是妊娠期DR患者预后不良的危险因素,并对妊娠期DR患者的不良预后具有一定的诊断价值。ROC曲线结果表明miR-200c-3p、miR-20b-5p 联合检测对DR患者不良预后的诊断具有较好的准确度,且具有较高的灵敏度。

综上所述,妊娠期DR患者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平升高,两者对于妊娠期DR患者不良预后具有一定的诊断价值,血清miR-200c-3p、miR-20b-5p 水平的升高为妊娠期DR患者不良预后的危险因素,但DR发病机制复杂,影响因素多样,本研究只是初步探究miR-200c-3p、miR-20b-5p 与妊娠期DR的关系,样本量较少,因此仍需深入研究。