斜率校正一测多评法同时测定茯苓中3种三萜酸成分的含量

赵 鑫，谷丽华，杨 莉，王峥涛

1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，国家中医药管理局中药新资源与质量评价重点实验室（上海 201203）；2.上海中医药大学交叉科学研究院（上海 201203）；3.上海中药标准化研究中心（上海 201203）

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，始载于《神农本草经》，具有利水渗湿、健脾宁心的功效［1-2］。茯苓中富含多糖、三萜酸、蛋白质、氨基酸、挥发油和甾醇等多种成分，其中多糖和三萜酸是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和利尿等多种作用［3-5］。茯苓在中药临床与配伍应用中十分广泛，2020 年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）一部中的成方制剂共收录1 607 种，其中含有茯苓的共有252种（如六味地黄丸、四君子丸、桂枝茯苓丸等），约占16%。因此提升茯苓药材的质量标准十分重要。

中药作为一个多成分复杂体系，检测单一成分难以全面反映药材内在质量，多指标含量测定已成为发展趋势。但由于多成分测定使对照品成本增加，因此基于单外标校正测定多指标成分含量的方法，即一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）被广泛应用于中药质量控制［6-7］。相对校正因子（relative correction factor，RCF）是QAMS的关键参数，直接影响到QAMS的定量准确度。

斜率校正是计算RCF 的一种方法，该方法以线性斜率为计算参数，测算校正因子较多点校正法更为简便，且在结果上与外标测定法无显著差异［8］。因此，本研究建立斜率校正一测多评法测定茯苓中3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的含量，以期为提升茯苓药材的质量标准提供参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器 Agilent 高效液相色谱仪，美国Agilent公司（型号：Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260）；Waters 高效液相色谱仪，美国Waters 公司（型号：E2695）；电子分析天平，北京赛多利斯公司［型号：BT25S 型（十万分之一）、BSA124S-CW 型（万分之一）］；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司（型号：KQ-250DB）；超声纯水仪，上海泽权仪器设备有限公司（型号：ZP15D1）。

1.2 试剂与药材 茯苓酸（纯度＞98%），成都普菲德生物技术有限公司（批号：JOT-10611）；去氢茯苓酸（纯度＞98%），成都格利普生物科技有限公司（批号：JOT-10749）；3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸（纯度＞98%）；成都德思特生物技术有限公司（批号：DST210811-012）；色谱纯乙腈、甲醇、磷酸，均购于国药集团化学试剂有限公司（批号分别为20210804、20210906、J5640045）；水为超纯水。

20批茯苓样品信息见表1，经上海中医药大学吴立宏研究员鉴定为茯苓Poria cocos（Schw.） Wolf 的干燥菌核。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，流动相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液（84∶16）；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长为210 nm。

2.2 对照品溶液的制备 取3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸对照品适量，精密称定，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.214 0、0.244 4、0.298 8 g/L 的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液1 mL，混合均匀，得到对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取茯苓粉末（过4 号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min（功率250 w，频率40 kHz），放冷，置室温后再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL 容量瓶中，定容，摇匀后过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 取供试品、对照品混合溶液、甲醇溶液适量，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，结果见图1。各待测成分色谱峰分离度均大于1.5，达到基线分离，表明该方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的对照品混合溶液，加甲醇逐级稀释，配制一系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，以峰面积（Y，mAU）对浓度（X，mg/L）绘制标准曲线。线性关系结果见表2。

表2 3种被测成分的线性关系、检测限和定量限

2.4.3 精密度试验 取同一批茯苓样品（FL-10）粉末1.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次并记录色谱峰峰面积，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积的RSD分别为1.51 %、1.69 %和0.13 %，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 分别取同一批茯苓样品（FL-10）粉末6 份，每份约1.0 g，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的平均含量分别为0.142 4、0.231 1、0.694 3 mg/g，RSD分别为1.44 %、1.19 %和0.65 %，表明方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定并记录色谱峰峰面积，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积的RSD分别为1.68%、1.80%和0.21%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 加样回收试验 分别取3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸对照品储备液4、6和12 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.034 2、0.058 7、0.143 4 g/L 的混合对照品溶液。取已知含量的茯苓样品（FL-10）粉末9 份，每份约0.5 g，精密称定，分别置锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液1、2、3 mL（相当于供试品中各指标成分含量的50%、100%、150%），每个梯度各3 份；分别按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表3。经计算得到3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的平均回收率分别为100.32%、106.12%、107.16%，RSD分别为4.16%、2.08%和2.04%。

表3 茯苓含量测定加样回收试验结果

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同色谱柱考察 取同一供试品溶液（FL-10），分别使用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 根色谱柱进行测定。结果显示 3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为2.00%、0.36%、0.56%，3根色谱柱对检测结果影响较小，表明方法耐用性良好。

2.5.2 不同仪器考察 取同一供试品溶液（FL-10），比较仪器Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695 对茯苓含量测定的影响。结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为2.84%、1.95%、0.56%，表明不同仪器对检测结果影响较小。

2.5.3 不同流动相pH 考察 取同一供试品溶液，分别以0.05%、0.10%和0.15%的磷酸作为流动相B 进行测定。结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为0.51%、1.16%、0.20%，表明流动相的磷酸浓度在0.05%～0.15%范围均可进行试验。

2.5.4 不同流速考察 取同一供试品溶液（FL-10），分别在0.6 mL/min、0.8 mL/min 和1.0 mL/min 流速下比较茯苓含量测定结果，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为0.92%、1.32%、0.18%，表明在0.6～1.0 mL/min 的流速下均可进行试验，方法耐用性良好。

2.5.5 不同柱温考察 取同一供试品溶液（FL-10），分别在28 ℃、30 ℃和32 ℃柱温条件下进行测定，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为0.55%、0.16%、1.55%，表明在28 ℃～32 ℃的柱温下均可进行试验。

2.5.6 不同进样量考察 取同一供试品溶液（FL-10），分别进样5 μL、10 μL 和15 μL 进行分析，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为3.31%、3.36%、0.81%，结果表明进样量对检测结果无明显差异，表明方法耐用性良好。

2.5.7 不同波长考察 取同一供试品溶液（FL-10），分别在208 nm、210 nm及212 nm下检测，结果3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分别为0.04%、1.64%、0.06%，表明所建立的分析方法在208～212 nm波长范围内检测耐用性良好。

2.6 校正因子计算 根据“2.4.2”项下所得到的各化合物线性曲线的斜率，代入fs/k的计算公式。以茯苓酸为内参（s），计算茯苓酸对3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸的校正因子f1，茯苓酸对去氢茯苓酸的校正因子f2，分别为0.71 和1.43。斜率校正因子计算公式为：fs/k=as/ak。其中as为茯苓酸内参物的线性方程斜率，ak为被测组分k的线性方程斜率。

2.7 不同仪器及色谱柱对校正因子的影响 将“2.4.2”项下的系列浓度对照品溶液分别精密吸取10 μL，分别采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 根色谱柱，在Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695高效液相色谱仪上进样检测，求算以茯苓酸为内参下的2种成分的fs/k，结果见表4及表5。结果表明，校正因子在使用不同仪器及不同色谱柱时耐用性良好。

表4 不同色谱柱的校正因子

表5 不同仪器的校正因子

2.8 相对保留时间法预测待测成分出峰位置 待测色谱峰可通过相对保留时间进行定位；计算公式为：RT=tk/ts。ts为茯苓酸内参物的保留时间，tk为被测组分k的保留时间。

分别采用3 台不同仪器（Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695）及不同厂家的色谱柱（Agilent ZORBAX SB-C18、Shim-pack GIST C18-AQ、CAPCELL PAK C18）在“2.1”项下色谱条件进样分析，记录3 个被测成分的保留时间，计算3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸的相对保留时间（RT1）及去氢茯苓酸的相对保留时间（RT2），测定结果见表6及表7。各仪器及色谱柱测定结果RSD均小于3%，表明相对保留时间在不同仪器及色谱柱之间的重复性良好，可用于待测成分的色谱峰定位。

表6 不同色谱柱的相对保留值

表7 不同仪器的相对保留值

2.9 一测多评法和外标法比较 采用对照品外标法及一测多评法分别测定20 批茯苓中3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的含量（mg/g），结果见表8。一测多评法测定结果与外标法测定结果无明显差异［相对误差（RE）＜5%］。

表8 一测多评法与外标法结果比较（n=2）

3 讨论

3.1 提取方式的优化 为全面评价茯苓的药材质量，本实验对茯苓样品的提取条件进行了优化。对不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、乙醇、乙酸乙酯）、不同料液比（1∶30、1∶50、1∶100）、不同提取方法及提取时间（超声30 min、45 min、60 min；回流1 h、1.5 h、2 h）进行了系统考察。发现提取溶剂对茯苓中3 个三萜酸成分的提取具有显著影响，甲醇提取效率最高，其他参数对提取结果影响不大，因此选择甲醇作为最终提取溶剂，同时从实验操作简便性考虑选择超声30 min为提取方案。

3.2 内参物的选择 茯苓酸是茯苓中的主要活性成分之一［9］，在茯苓中含量较高，该对照品相对价廉易得；在本实验条件下茯苓酸与其他被测成分分离度良好，达到含量测定要求［分离度（R）＞1.5］，出峰位置适中，符合内参物的选择原则［10］，因此选择茯苓酸作为内参物能够体现“一测多评法”实用和准确的特点。

3.3 斜率校正法的优势 中药多指标分析是中药质量评价现代化发展的必然趋势，但大量对照品的制备分离难度严重制约了其发展。一测多评法的出现为中药复杂体系的品质评价提供了新策略［11］。它在中药材和成方制剂中的应用研究已经很多［12-15］，其中也包括对茯苓中三萜酸成分的含量测定的应用［16-17］。多点校正法依然是一测多评法校正因子的主要计算方法，但多点校正法在使用中存在一定局限性，易产生特殊点的偏差从而影响整个计算结果［18］。斜率校正法通过线性回归拟合，避免了可能存在的特殊点偏差，简化实验操作和计算的同时，计算结果也更加科学准确［19］。目前针对茯苓中三萜酸成分含量测定开发的方法存在色谱条件复杂、分析时间较长等弊端［20-22］。本研究采用等度洗脱的色谱条件在较短时间内完成茯苓中3 种三萜酸成分的基线分离。

3.4 总结 本实验建立的“斜率校正一测多评法”用于测定茯苓中3个三萜酸成分的含量，并考察了不同仪器和不同色谱柱等关键影响因素，结果显示一测多评法与外标法的含量测定结果无明显差异，表明该一测多评方法可用于茯苓中三萜酸类成分的含量测定，为茯苓药材质量控制提供了科学简便的方法。