miRNAs对动脉粥样硬化作用的研究进展

陈雅娇 李涛 许泼实★

《中国心血管健康与疾病报告2021》显示我国心血管病现患人数3.3 亿，其中脑卒中1 300万、冠心病1 139 万、高血压2.45 亿，心血管病的发病率与致死率高居疾病榜首，防控形势依然严竣。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、中风和猝死等心脑血管疾病的主要病理因素。AS 是由血脂代谢异常引起、多种因素参与的病理生理过程［1］，其形成的机制复杂，尚未完全阐明。因此，进一步从内皮细胞（Endothelial cells，ECs）和血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）改变、炎症反应、脂质代谢、免疫氧化应激等领域探讨AS 的发生发展机制尤为重要。miRNAs 作为细胞粘附、增殖、脂质摄取及炎症介质生成等过程的重要调控因子，为研究AS 形成机制提供新的分子视角。

1 miRNA 在AS 发病机制中的作用

1.1 miRNAs 概述

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是进化保守、约18～24 个核苷酸的单链非编码RNA，结合特定靶mRNA 序列的3′-非翻译区（3′-UTR），通过阻断mRNA 翻译和/或促进mRNA 降解导致蛋白表达减少。据估计，60%的蛋白质编码基因直接受miRNAs 调控。现已在人类发现超过2 000 种miRNAs，由于每种miRNA 可以调节多个基因的表达，且每个特定的基因可被多个miRNAs 调节，因此miRNAs 是调控多种病理生理过程基因表达的关键靶点［2］。鉴于miRNAs 的固有特性，其作为AS 各个阶段mRNA 和蛋白表达的关键调控因子已得到临床和病理研究的支持。

1.2 miRNA 与ECs 功能异常

AS 病变始于血管内膜，内膜脂质累积引起ECs 激活伴通透性变化，并发生表型转换，包括异常迁移、增殖及黏附分子等表达改变，这些改变又刺激炎症细胞在内皮下和内膜中粘附和迁移，引起ECs 受损，继而出现脂质点、脂质条纹、粥样斑块和复合病变，导致AS 的发生。研究发现，多种miRNAs 参与AS 病变过程中ECs 功能的调控，包括衰老、凋亡及氧化还原过程等。在AS 患者血浆中，miR-34a 的表达水平显著升高，并下调Sirtuin-1（SIRT1）基因的表达促使ECs 衰老［3］。SIRT1作为长寿的关键调节基因，保护细胞免受氧化和毒性应激来阻止应激诱导的衰老，这说明miR-34a 参与了ECs 衰老过程的调控。多种调控ECs 凋亡的miRNAs 也参与到AS 进程中。miR-34a 不仅可以参与上述ECs 衰老调控，还可以靶向B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）基因抑制氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）诱导的ECs 凋亡，促进ECs 增殖，延缓AS的进展［3］。miRNAs 还可通过调控氧化还原平衡来影响ECs 的功能。一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，eNOs）、NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）等是维持细胞氧化还原平衡的必须酶。在ECs 中，miR-155 能够下调eNOS3基因的表达影响细胞氧化还原平衡［4］。miR-146a 通过靶向在缺血和炎症应激期间对血管系统发挥保护作用的NOX基因来对抗ECs 的氧化［5］。

1.3 miRNAs 与VSMCs 功能异常

VSMCs 表现出显著的表型可塑性，即从收缩状态去分化为合成状态，同时增加增殖和迁移能力，这是AS 进展的关键步骤。越来越多的研究表明，miRNAs 对于调节VSMCs 的表型转换及增殖、迁移至关重要。一些miRNAs 对VSMCs 的增殖和迁移发挥促进作用。如miR-21 直接靶向SPRY1基因促进VSMCs 去分化为合成表型，增加VSMCs 增殖和迁移能力［6］。此外，miR-491-5p 也能够促进VSMCs 的增殖及迁移［7］，这些miRNAs共同促进AS 发展。然而一些miRNAs 对VSMCs 的增殖和迁移发挥抑制作用。在AS 模型中miR-145的表达下调，通过细胞骨架组织的改变来调节VSMCs 对球囊损伤的增殖反应，并促进VSMCs 收缩，抑制增殖性表型［8］。AS 斑块中发生血管内膜钙化，同时伴随着细胞坏死、炎症反应等，对AS 产生极大的影响。在ox-LDL 诱导的VSMCs 钙化细胞模型中，miR-33a-5p 表达显著下调，并通过靶向甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）基因抑制ox-LDL 诱导的VSMC 钙化［9］。在血管钙化的细胞模型中，利用miR-27a-3p 抑制物处理细胞，导致钙化增加，且激活的转录因子3（Activating transcription factor 3，ATF3）蛋白增加，说明miR-27a-3p 通过调控ATF3基因表达减少血管的钙化［10］。

1.4 miRNA 与胆固醇代谢

胆固醇是AS 病变各阶段的关键参与者，胆固醇稳态对细胞生理学至关重要，胆固醇稳态失衡导致其在细胞内积累。胆固醇代谢多个阶段都受到miRNAs 的调控，如胆固醇的生物合成。miR-122 是第一个被发现参与胆固醇代谢的miRNA，抑制miR-122 的表达导致小鼠体内胆固醇调节元件结合蛋白1（Sterol-regulatory element binding proteins-1，SREBP1），脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FASN）等胆固醇合成相关基因表达下调，胆固醇水平显著降低［11］。miR-185 直接靶向SREBP2基因，抑制SREBP2 蛋白的表达，调节胆固醇生物合成途径［12］。

miRNAs 通过靶向低密度脂蛋白受体（Low-Density Lipoprotein Receptor，LDLR）调控胆固醇生物摄取。肝脏中LDLR 促进循环中LDL 颗粒的清除，是血浆胆固醇水平的主要调节因素。在小鼠体内抑制miR-128-3p 的表达可以增加循环中标记LDL 的清除率并降低血浆LDL-C 的水平［13］。miR-224 和miR-520d 均可以通过LDLR 调控LDL-C 的水平［14］。

此外，miRNAs 还参与调控胆固醇的逆向转运。胆固醇不能在肝外被降解，必须运输到肝脏重新使用和外排，这个过程称为胆固醇的逆向转运（Reverse Cholesterol Transport，RCT）。细胞胆固醇外排受ATP 转运蛋白调控，包括三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1）和三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ATP-binding cassette transporterG1，ABCG1）。研究发现miR-33a 和miR-33b 是胆固醇和脂肪酸稳态的关键调节因子［15］。miR-33 的过度表达抑制ABCA1 蛋白表达，并减少了细胞内胆固醇向Apo-A1 流出。而抑制miR-33 表达导致ABCA1 蛋白表达增加，血浆HDL 水平升高，促进AS 消退。

1.5 miRNA 与炎症反应

AS 被认为是一种慢性炎症性疾病，炎症是AS过程中病理变化的共同基础。在AS 发展过程中，局部的微环境会发生复杂的变化，并且伴随着多种免疫细胞浸润，尤其是单核细胞源性巨噬细胞、树突状细胞等。巨噬细胞是AS 病变中最丰富的白细胞亚群，微环境诱导巨噬细胞启动不同的激活程序，分化为经典促炎表型（M1 表型）和抗炎表型（M2 表型），AS 的进展主要与M1 型巨噬细胞的激活有关［16］。研究发现，抑制miR-92 通过调控Kruppel 样因子4（Kruppel like factor 4，KLF4）基因抑制巨噬细胞活化、诱导其从促炎性M1 向抗炎性M2 表型极化从而缓解AS 形成。miR-92 对巨噬细胞促炎性激活有增强作用，miR-92 抑制处理的巨噬细胞表现出M2 型生物标志物增加的特性［17］。树突状细胞通过感应和呈递斑块中的抗原，参与先天性免疫和适应性免疫。miR-155 通过阻断促炎细胞因子的分泌和减少树突状细胞表面分子CD40 和CD83 的表达减弱ox-LDL 诱导的炎症反应［18］。除炎症细胞外，介导炎症反应的关键信号分子同样参与到整个AS 过程中。Toll 样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）是先天免疫反应中模式识别受体的典型代表，它能刺激促炎细胞因子释放，促进泡沫细胞形成。在ox-LDL 诱导的THP-1 细胞中，miR-140-5p 的表达明显降低，miR-140-5p 下调TLR4基因表达，抑制ox-LDL 诱导的THP-1 细胞炎症因子释放［19］。miR-217 也可以下调TLR4基因发挥其对炎症反应、氧化应激反应的抑制作用，发挥抗AS 的功能［20］，为抑制AS 发展提供了新的思路。过氧化物酶体增殖物活化受 体（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）是一种配体激活的转录因子，其主要功能是将体内的稳态变化等转化为细胞内信号。在AS 小鼠模型中，过表达miR-130a 促进炎症因子的表达，同时抑制PPARγ 基因表达，上调NF-κB蛋白表 达水平［21］，即miR-130a 过表达调控PPARγ 基因诱导NF-κB 增加炎症因子的水平，促进AS 发展。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）在AS 炎症基因信号转导及调节中至关重要。研究发现，miR-124 在AS 小鼠中表达量显著改变，在ox-LDL 诱导的巨噬细胞中，用miR-124 模拟物处理细胞，巨噬细胞内促炎症因子分泌减少，抗炎因子表达增加［22］。

如前所述，miRNAs 参与AS 形成多过程，具体研究不同miRNAs 调控的不同过程，有助于对AS的发病机制进行完善。参与AS 病理生理过程调控的miRNAs 均可能作为调控AS 的分子靶点，成为诊断、治疗AS 的重要策略。

2 miRNA 作为AS 诊断标志物

miRNAs 可以在血液、尿液等体液稳定存在，且部分miRNA 在AS 不同病理阶段细胞或组织特异性表达，这使得它们非常适合成为非侵入性生物标志物。冠心病患者循环中miR-21、miR-92a 等水平增加，其中miR-21 在AS 患者血清增加最为显著。且miR-21 的表达在有症状和无症状的斑块之间具有显著差异，提示miR-21 可作为区分有无症状斑块负荷的潜在生物标志物［23］。此外，监测循环miRNAs 的水平可作为评估疾病严重程度的指标，在AS 患者中，miR-223 和miR-126 表达降低导致其相关靶基因活性增加，从而使AS 斑块纤维帽稳定性显著降低，因此miR-223 和miR-126 在评估颈动脉斑块破裂的风险中有重要临床应用价值［24］。miRNAs 在体液中广泛存在且样本较易采集。因此其作为诊断AS 标志物具有广阔前景，但仍需大量的研究寻找高灵敏度、高特异性的标志miRNAs。

3 miRNA 作为AS 治疗新靶点

miRNAs 不仅为理解AS 发病机制提供了一个新视角，还极大可能成为治疗AS 新靶点。几类基于RNA 的治疗药物正处于临床开发阶段，可分为miRNA 模拟物和miRNA 抑制剂。

miRNA 抑制物是单链的，其设计用于靶向mRNA，通过强烈结合阻断mRNA 的功能。临床前研究表明，通过全身递送靶向miR-33 的反义寡核苷酸增加ABCA1 的表达，减少了AS 小鼠斑块负荷［25］。小干扰RNA（siRNA）与目标mRNA 互补结合时，可以实现RNA 的敲低。在小鼠体内沉默miR-351 可以有效缓解小鼠AS，其相关靶基因siRNA 的转染逆转了miR-351 沉默诱导的细胞凋亡下降、脂质积累减少和氧化应激水平降低［26］。

使用miRNAs 模拟物递送是另一种有吸引力的治疗方法，miRNA 模拟物是合成的双链小RNA分子，以补充在疾病状态下丢失的miRNAs 表达。例如，在载脂蛋白E-小鼠主动脉内膜和血浆中，miR-181b 表达显著下调，miR-181b 模拟物的全身递送使其表达增加2～3 倍，与对照组相比可显著减少AS 形成［27］。体外培养的ECs 转染miR-126-5p模拟物，ECs 增殖明显且凋亡减少［28］，有望成为治疗AS 的新策略。

4 总结与展望

miRNAs 调节AS 过程的作用引起人们广泛关注，近年来此方面的研究迅速增加，并取得巨大进展。但基于miRNAs 的基因表达调控在生理和病理状态下仍存在许多问题。在AS 中，许多针对不同蛋白质和mRNA 的miRNAs 已经被研究，但是在病理状态验证这些靶标是极具挑战的，因为miRNAs调节不同细胞类型和不同生物体的异质性，需要进一步考虑多个基因之间的组合或特定的相互作用，这在AS 生理和病理状态下的作用非常重要。为开发基于miRNAs 的治疗方法，重要的是考虑一组miRNAs 在AS 系统内是否具有协同作用。此外，miRNAs 在AS 发生发展过程中新调控机制的不断涌现，给AS 诊断、治疗及预后带来新的希望。