基于TCGA数据库分析DDX27在肝细胞癌中的预后价值

朱翠雯 马甜甜 段怡平 陈梁玥 李东旭 柳家翠 喻明霞 杨桂

肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是一种高死亡率的原发性肝癌，是肝癌的主要组织学亚型，极少数的肝癌为胆管细胞癌及混合型［1］。我国是肝癌的高发国家，发病率和死亡率均处于较高水平，这可能与我国是乙肝大国相关。肝癌起病隐匿，在发现时往往已经是晚期，且预后较差，故手术切除治疗的效果不佳［2］。肝癌预后差的原因在于其复发率和转移率高，移植是治疗晚期肝癌最有效的方法。肝癌的发生与长期大量饮酒、丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎等因素相关，我国肝癌发生的主要原因是乙型病毒性肝炎，其中肝硬化是肝癌最大的危险因素［3］。2021年的癌症统计数据显示，肝癌的五年生存率极低，仅18%［4］。目前，肝细胞癌的诊断是通过计算机断层扫描或磁共振成像以确认，如果放射学检查结果不确定，可以考虑肝活检或重复成像以确认［5］。早发现早治疗是降低肝癌死亡率的最佳方式，因此研究者在寻找肝癌的肿瘤标志物方面进行了大量的研究，以期为肝癌的早期诊断提供更好的依据。

DEAD-BOX RNA 解旋酶（DEAD-Box Helicase 27，DDX27）基因是一种蛋白质编码基因。研究表明，DDX27基因与乳腺癌，胃癌，结直肠癌等的发生发展密切相关，通过增强干细胞样的特性来促进乳腺癌的发展，能够抑制细胞凋亡［6-8］。然而，目前关于DDX27基因与肝细胞癌之间的预后价值尚无报道。本研究基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中2021 年8月25 日之前纳入的肝细胞癌的表达数据及临床数据，分析DDX27基因在肝细胞癌中的表达差异，并对该基因与肝细胞癌的临床特征以及预后相关进行探讨，最后分析了DDX27基因相关的信号通路。

1 资料与方法

1.1 数据的下载与处理

在TCGA 数据库官方网站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载肝细胞癌RNA-seq（level 3，HTSeq-FPKM）数据，其中包括肝细胞癌组织样本374 例，正常肝组织样本50 例。利用R.4.0.3 软件和Strawberry Perl 5.32.0.1 软件对下载的基因表达数据进行处理，转化后用于后续分析。在TCGA 数据库下载并提取肝细胞癌患者的临床病理特征信息，仅保留生存时间、生存状态、年龄、性别、Stage 分期、T 分期、N 分期、M 分期信息均完整的患者数据。

1.2 DDX27 基因表达与临床特征及预后的相关性分析

根据DDX27在肝细胞癌患者中表达水平的中位值，将肝细胞癌患者分为高表达组和低表达组。使用IBM SPSS Statistics 20.0 统计软件分析DDX27表达与患者的年龄、性别、Grade 分期、Stage 分期、T 分期、M 分期、N 分期的相关性。使用OncoLnc在线数据库（http：//www.oncolnc.org/）、GEPIA 在线数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）以及Kaplan-Meier Plotter 在线数据库（https：//kmplot.com/analysis/）验证DDX27与患者总体生存率（overall survival，OS）的关系。根据TCGA-LIHC 数据库中肝细胞癌患者的生存数据，结合DDX27的表达量，使用单因素和多因素cox 回归分析对DDX27在肝细胞癌患者中的预后价值进行研究。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 软件进行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）数据库中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集作为功能基因集。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设为1 000 次。以P＜0.05 和错误发现率（false discovery rate，FDR）小于0.05 的基因集作为显著富集的基因集。

1.4 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析；计数资料以n（%）表示；使用Mann-Whitney U 检验分析DDX27在肝细胞癌样本和肝正常组织样本中的表达差异；采用卡方检验对DDX27表达与患者临床特征进行相关性分析；生存分析使用Kaplan-Meier法；cox 比例风险回归模型用于评价DDX27的预后意义；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DDX27在肝细胞癌组织中的表达

在TCGA-LIHC 数据集中，与正常组织相比，肿瘤组织中的DDX27表达显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A-B。UALCAN 数据库的结果显示，与TCGA 结果一致，肿瘤组织的表达量显著高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1C。

2.2 DDX27与肝细胞癌患者临床病理特征的联系

低表达组与高表达组之间的临床特征比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。DDX27与Grade 分期有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 DDX27表达与肝细胞癌患者临床特征的相关性分析［n（%）］Table 1 Analysis of the correlation between DDX27 expression and clinical characteristics of patients with liver hepatocellular carcinoma［n（%）］

2.3 DDX27表达与肝细胞癌预后的关系

在TCGA 数据库中，DDX27的表达与肝细胞癌患者的总体生存率相关，且高表达组的总体生存率显著低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2A；Kaplan-Meier Plotter、GEPIA、OncoLnc 在线数据库验证了TCGA 数据库的结果，见图2B-D。单因素和多因素cox 回归分析结果见表2。

图2 DDX27 与肝细胞癌患者预后的相关性分析Figure 2 Analysis of the relationship between DDX27 and prognosis of patients with liver hepatocellular carcinoma

表2 肝细胞癌患者单因素和多因素cox 回归分析Table 2 univariate and multivariate cox regression analysis of patients with liver hepatocellular carcinoma

2.4 基因富集分析结果

GSEA 分析结果显示，DDX27主要参与了20条信号通路（P＜0.05，FDR＜0.05）。其中包括了RNA 降解、细胞周期、核苷酸切除修复、胞质DNA传感通路、同源重组、嘌呤代谢等致癌相关的途径。见表3、图3。

表3 DDX27 基因功能富集分析结果Table 3 results of functional enrichment analysis of DDX27 gene

图3 DDX27 基因高表达样本相关富集基因集Figure 3 High expression of DDX27 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

3 讨论

目前对于肝癌的早期筛查主要是通过影像学和血清学联合监测，甲胎蛋白是最常用的血清学标志物，超声检测是最常用的影像学手段［9-11］。血清甲胎蛋白≥400 ng/mL 超过1 个月，排除妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤及其他消化道肿瘤后，高度提示肝细胞癌。但由于肝癌起病隐匿，进展迅速，大多数患者在确诊时已经处于中晚期，因此，早期筛查和诊断成为提高肝细胞癌的生存率的关键。

为了早发现早治疗，研究者从分子层面进行了大量研究，发现与肝细胞癌密切相关的基因有PTEN基因、p53基因、IGF-2基因、TGF-α基因、c-myc基因、ras基因等，这些基因直接参与介导肝癌的发生、发展［12-14］。DDX27编码的以保守基序Asp-Glu-Ala-Asp（DEAD）为特征的DEAD 盒蛋白属于RNA 解旋酶，参与许多涉及RNA 二级结构改变的细胞过程，例如RNA 运输、RNA 降解、葡萄糖代谢、脂质代谢、核糖体生物合成、肿瘤发生、发展等多种过程［6，15-17］。该蛋白参与5.8S 和28S 核糖体RNA 的加工，其定位于核仁，并与PeBoW 复合物相互作用以确保47S rRNA 的正确3′末端形成［18］。

研究表明DDX27的上调能增强和延长TNF-α介导的NF-κB 信号通路，而NF-кB 是参与肿瘤起始、进展和转移的关键，调控因子NF-κB 通路的增强表明DDX27可能促进上皮-间充质转化（EMT）的过程，从而促进乳腺癌和结直肠癌的发生和转移［6-7］。此外，DDX27基因在胃癌中的表达上调亦有报道［8］。DDX27能够增强干细胞样特性，抑制细胞凋亡从而促进肿瘤的发展［6］。这些研究结果都表明了DDX27在肿瘤中扮演了重要的角色，可作为人类肿瘤的新型分子标志物。

本研究通过对TCGA 数据库进行数据挖掘，并且在多个在线数据库进行验证，发现DDX27mRNA 在肝细胞癌中的表达显著上调，高表达患者的总体生存率显著低于低表达患者，单因素和多因素cox 分析结果均提示DDX27与肝细胞癌的不良预后相关。并且利用GSEA 富集分析发现DDX27通过调控多种分子途径参与肝细胞癌的发生发展，如参与RNA 降解、细胞周期、核苷酸切除修复等途径。以上研究提示，抑制DDX27的表达，阻断DDX27介导的信号通路或许可以成为肝细胞癌的诊断和治疗策略。

综上，DDX27在肝细胞癌中高表达，并与肿瘤的恶性程度相关，高表达的DDX27提示患者预后不良。DDX27可以作为肝细胞癌的一个独立预后因素，并有望成为肝细胞癌治疗的新型分子靶点。