神经冰冻切片刚果红染色技术在周围神经病病理诊断中的应用效果探讨

朵建英, 陈 海, 徐 敏, 邸 丽, 朱文佳, 黄 月, 文欣玫, 卢 岩, 王 敏, 笪宇威

淀粉样物质是由蛋白质变性所致,亦可称为淀粉样变。淀粉变性病是由于不同结构的异常蛋白在机体内不同组织和器官沉积所致[1-4]。淀粉样物质可沉淀在血管周围,累及周围神经,导致淀粉样变性周围神经病[5-7]。刚果红染色是对淀粉样物质沉积最经典且有效的病理染色方法[8-11]。实验室常用石蜡切片进行刚果红染色[9],不同试剂盒、染色流程、染色条件均会影响染色结果[12-14]。即使是使用同一试剂盒,对于不同组织的染色条件也有所差别[15-16]。笔者在临床实践中发现,应用刚果红染色试剂盒对石蜡及冰冻标本进行染色(染色时间5 min),冰冻肌肉标本可得到良好的染色结果,但冰冻神经标本往往观察不到理想的结果。鉴此,笔者通过对染色时间及切片厚度进行了反复测试,以期获得神经冰冻切片刚果红染色的最佳条件,为淀粉样周围神经病的快速病理诊断提供准确证据。

1 材料与方法

1.1标本来源 选择2022年8月于首都医科大学宣武医院神经内科收治的1例淀粉样周围神经病患者,取得腓肠神经的活检组织标本,迅速进行液氮冷冻处理,以OCT(optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋,固定于软木片上,-80 ℃冰箱长期保存备检。排除标准:(1)活检标本未发现异常物质沉积;(2)活检石蜡标本切片刚果红染色偏振光下未见苹果绿色。本研究获医院医学伦理委员会批准。

1.2刚果红染色方法

1.2.1 染色试剂 淀粉样物质染色液(Highman刚果红法,雷根生物,DG0022),包括Highman刚果红染色液(A液)、碱性乙醇分化液(B液)、Leagene苏木素染色液(C液)。

1.2.2 标本制备 将神经组织标本进行冰冻切片(横切或纵切),切片后采用丙酮固定15 min。

1.2.3 实验分组 本研究主要观察刚果红染色时间及切片厚度对染色结果的影响。染色时间设置5 min、10 min、15 min、20 min四个亚组;切片厚度设置6 μm、8 μm两个亚组,共8组,每组横切和纵切各3张切片。

1.2.4 染色过程 将固定后的冰冻切片以自来水冲洗1 min,根据分组放入Highman刚果红染色液(A液)分别浸染5 min、10 min、15 min、20 min。随后将切片放入碱性乙醇分化液(B液)分化5 s,予自来水冲洗1 min终止分化。将切片放入Leagene苏木素染色液(C液),染核1 min,自来水冲洗5 min,放入蒸馏水分化2 min。逐级常规乙醇脱水,以二甲苯进行透明化处理,中性树胶封片。

1.2.5 染色结果观察 使用Leica DM2500光学显微镜对染色结果进行观察。以神经组织切片中出现砖红色无定型物质(一般为团块状),并且该物质在偏振光下呈现苹果绿色双折光,则判定为刚果红染色阳性。在普通光学显微镜下,淀粉样蛋白砖红色按照着色强度分为弱(略显砖红色)和强(显鲜艳砖红色)两个等级。在荧光显微镜下(激发光波长540～565 nm,发射光波长605～660 nm),淀粉样蛋白呈大红色荧光,按照荧光强弱分为弱(略显红色荧光)和强(显现十分鲜艳红色荧光)两个等级。

1.3组织化学染色方法

1.3.1 标本制备 将神经组织标本进行冰冻切片,纵切或横切,厚度为6 μm、8 μm各3张切片。

1.3.2 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE) 切片晾干后进行HE染色:切片置入Harris苏木精液2 min,自来水冲洗10 min后置入1%伊红1 min;自来水快速冲洗1 min,逐级常规乙醇脱水,以二甲苯进行透明化处理,中性树胶封片。

2 结果

2.1HE染色及刚果红染色结果 HE染色切片可观察到有淀粉样物质沉积物,呈不定形的粉红色团块状物质,偏振光下该物质团呈苹果绿色。石蜡切片、冰冻切片经HE染色和刚果红染色后在光镜下均能观察到粉红色物质沉积及砖红色物质。但冰冻切片整体对比度更强,特别是经刚果红染色时,冰冻切片能更好地将淀粉样物质沉积从背景颜色中区分出来。偏振光下石蜡切片及冰冻切片均能观察到苹果绿色。见图1。

ⓐ～ⓓ为石蜡切片观察所见:ⓐ神经内膜见粉红色团块状物质,着色弱(HE染色,×100);ⓑ神经内膜见粉红色团块状物质,着色弱(HE染色,×200);ⓒ神经内膜见砖红色团块状物质,着色强(刚果红染色,×100);ⓓ偏光镜下观察见苹果绿样沉积(刚果红染色,×200)。ⓔ～ⓗ为冰冻切片观察所见:ⓔ神经内膜见粉红色团块状物质,着色弱(HE染色,×100);ⓕ神经内膜见粉红色团块状物质,着色弱(HE染色,×200);ⓖ神经内膜见砖红色团块状物质,着色强(刚果红染色,×100);ⓗ偏光镜下观察见苹果绿样沉积(刚果红染色,×200)

2.2不同刚果红染色条件下光镜观察结果比较 染色时间为5 min时,6 μm厚的冰冻切片在光镜下观察到微弱的砖红色物质,在偏振光下基本不能观察到绿色荧光物质,而8 μm厚的冰冻切片也仅能观察到微弱的苹果绿色荧光物质。当染色时间为5 min、10 min、15 min和20 min时,8 μm厚的冰冻切片在光镜下观察到明显的砖红色物质,较6 μm冰冻切片更为显著。而当染色时间为10 min时,6 μm冰冻切片在偏振光下仍难以观察到苹果绿色荧光物质。当染色时间为15 min时,8 μm厚的冰冻切片在光镜下观察到较明显的砖红色物质,而在此条件下,偏振光下能观察到的苹果绿色荧光最为显著。见图2。

2.38 μm切片在不同刚果红染色时间条件下荧光显微镜观察结果 当染色时间为5 min、10 min、15 min、20 min时,荧光显微镜下均能观察到明显的橙红色荧光,其中以染色时间为15 min时荧光亮度最强。石蜡切片在荧光显微镜下呈现红色荧光,亮度弱。见图3。

ⓐ～ⓓ为8 μm冰冻切片观察所见:染色时间为5 min(ⓐ)、10 min(ⓑ)、15 min(ⓒ)、20 min(ⓓ)时,荧光显微镜下观察到橙红色荧光,亮度强(刚果红染色,×200)。ⓔⓕ为石蜡切片观察所见:染色时间为10 min,石蜡切片在荧光显微镜下呈红色荧光,亮度弱[刚果红染色,×100(ⓔ),×200(ⓕ)]

3 讨论

3.1刚果红染色于1922年由Bennhold发明[13],可用于活体内淀粉样物质的鉴定并应用到组织切片中,后经Highman、Freudenthal等学者进行改良。目前,本实验室应用的Highman刚果红法,其染色液主要由刚果红染色液和苏木素染色液组成,染色操作简单易行,染色液性能稳定,染色效果良好,较其他刚果红染色方法有明显优势。

3.2常规石蜡切片是制片技术中较为常用的方法,但操作步骤繁琐,所需时间较长,从取材凝固到制成标本需要消耗数日时间,而冰冻切片仅需耗时约7 h即可完成[13]。本研究应用丙酮固定15 min,可在1 h内得到刚果红染色及常规的HE染色结果。另外,本研究通过对神经石蜡切片和冰冻切片的刚果红染色在普通光、偏振光及荧光下的结果比较发现,冰冻切片染色结果对比度更高,更容易辨认,且荧光下染色物质亮度更强,有利于观察者对刚果红染色结果进行判定。因此,冰冻切片不但节省了从送检到诊断的时间,而且还提高了刚果红染色阳性判定的灵敏度,对神经系统疾病的临床诊断大有裨益。

3.3有研究证实,切片厚度对淀粉样蛋白的刚果红染色结果有影响,随着切片厚度变薄,染色强度变弱,当薄切片≤3 μm时容易出现假阴性[17]。本次研究中为了防止冰冻切片制备时出现卷片、碎片等现象,选用6 μm(冰冻切片免疫组化染色常用切片厚度)及8 μm(冰冻切片组织化学染色常用切片厚度)作为染色切片厚度,观察在这两个厚度条件下刚果红染色时间对染色结果的影响。另外,由于神经组织较小,容易出现脱片现象。经笔者前期反复试验,可用丙酮固定15 min替代4%甲醛、无水乙醇、Bouin液固定[18]。染色过程中复染细胞核的步骤为了避免过长时间冲水引起脱片,可选择苏木素复染1 min,相应的冲洗时间可由10 min缩短到5 min。

3.4淀粉样纤维能被刚果红染料染色,且该物质在偏振光下能呈现出特征性的苹果绿双折光,这是含有β-褶片结构蛋白质的特异表现,是诊断淀粉样变性病的重要依据[1,19]。在本研究中,切片厚度相同时,刚果红染色着色强弱随着染色时间增加而增强;染色时间相同时,染色颜色随着切片厚度增加而增强。同样的厚度下,染色20 min的特异性物质沉积砖红色过深,接近于紫红色,在偏振光及荧光下并没有呈现出更好的染色效果;在染色15 min时,6 μm及8 μm切片染色在普通光、偏振光、荧光下的效果均较好。

3.5在本研究中,当染色时间为5 min时,6 μm切片刚果红染色所见砖红色十分微弱,偏振光下基本观察不到苹果绿色物质,说明切片厚度不足时偏振光观察效果不佳[20]。而8 μm切片在染色5 min时能观察到苹果绿双折光,说明8 μm是较理想的切片厚度。当染色20 min时,8 μm切片砖红色过深,且在偏振光下也没有观察到更显著的苹果绿双折光。两种厚度切片在染色15 min时均可观察到较强的苹果绿双折光,这可能与淀粉样物质在组织中的含量或是刚果红染料与淀粉样纤维的结合原理有关。

3.6在荧光显微镜下观察刚果红染色能显著提高诊断的灵敏度[1,20-22]。本研究中,8 μm厚度切片在染色5 min、10 min、15 min、20 min时均能观察到十分明亮的红色荧光,且在染色时间为15 min时所见荧光最为显著,呈橙红色荧光,显著提高了阳性染色的辨别力与诊断灵敏度。同时,本研究发现冰冻切片较石蜡切片在荧光下显色效果更优。

综上所述,8 μm冰冻切片刚果红染色在A液中染色15 min时效果最好,光镜下呈鲜艳砖红色,偏振光下苹果绿也较明显,荧光显微镜下橙红色荧光也最强。该方法不但简化了实验过程,缩短了实验时间,还提高了染色灵敏度,有助于淀粉样周围神经病的诊断。