整合素β4蛋白在老年甲状腺乳头状癌组织中的表达水平及临床意义

李祖锦, 吴 敏, 孙传衍

甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤,与其他恶性肿瘤相比,具有恶性程度较低、治疗难度较小、患者预后较好的特点[1-2]。甲状腺癌有多种病理类型,以乳头状癌最为常见,约占所有甲状腺癌的85%～90%[3-4]。甲状腺乳头状癌患者年龄分布较广,且女性发病率约是男性的3倍,主要临床表现为颈部肿块、吞咽困难等,早发现、早治疗对改善患者预后有积极作用[5]。整合素β4(integrin β4,ITGB4)是整合素家族的一员,主要表达于上皮细胞的基膜侧。ITGB4胞外段可识别基底膜中的层黏连蛋白,与之构成半桥粒连接。胞内段由近1 000个氨基酸构成,是胞内段最长的整合素分子,参与BRAF/MEK/ERK等多条信号通路的调控,影响细胞增殖、凋亡与迁移等行为[6]。本文对甲状腺乳头状癌组织标本的ITGB4蛋白进行检测,旨在探讨ITGB4蛋白在甲状腺乳头状癌演进过程中的表达水平变化及临床意义。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2019年8月至2020年8月于海口市中医医院接受全甲状腺切除术治疗的甲状腺乳头状癌老年患者80例。其中男29例,女51例,年龄66～78(71.5±4.8)岁;病理分期Ⅰ期29例,Ⅱ期40例,Ⅲ期7例,Ⅳ期4例;分化程度高分化15例,中分化44例,低分化21例。另选取同期于我院接受手术治疗的结节性甲状腺肿患者50例作为对照。本研究获医院医学伦理委员会批准[批号:(2019)伦审第(12)号],研究对象知情同意。

1.2纳入与排除标准 纳入标准:(1)符合《中国临床肿瘤学会(CSCO)持续/复发及转移性分化型甲状腺癌诊疗指南-2019》[7]中关于甲状腺乳头状癌的诊断标准,经病理检查明确诊断;(2)年龄>65岁;(3)接受甲状腺乳头状癌肿瘤切除手术;(4)临床病历资料完整。排除标准:(1)合并其他部位肿瘤;(2)合并全身感染性疾病;(3)合并免疫系统疾病;(4)合并严重心脑血管疾病;(5)精神障碍或交流障碍。

1.3标本切取及制片 术中切取患者癌组织及癌旁组织(距边缘外至少2 cm,且HE染色未见异型细胞);切取结节性甲状腺肿患者病灶组织。组织标本大小约为5 mm×5 mm×5 mm。经10%甲醛溶液充分固定后,使用石蜡包埋,行组织切片,切片厚度3 μm,行免疫组化染色。

1.4免疫组化染色 将切割好的石蜡薄片置于恒温水浴锅内展开,烘烤2 h,二甲苯脱蜡,梯度酒精水化。将切片置于甲醇溶液中浸泡,消除过氧化酶活性。使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)反复冲洗3次,冲洗过程中注意动作轻柔,防止损坏切片。经柠檬酸盐抗原修复后加入羊血清封闭20 min,PBS冲洗后加入一抗,4 ℃冰箱孵育过夜。以PBS轻柔冲洗后加入二抗,孵育2 h,采用二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色,经苏木素复染后封片。根据染色强度和染色细胞占比进行免疫组化染色强度评分:阴性为0分;弱阳性为1分;阳性为2分;强阳性为3分。根据良性肿瘤细胞占比进行免疫组化染色程度评分:无染色细胞为0分;染色细胞占1%～10%为1分;11%～50%为2分;51%～75%为3分;>75%为4分。免疫组化染色评分=染色强度评分×染色程度评分,得分0～4分为低表达(低表达组,39例),>4分为高表达(高表达组,41例)。

1.5Western blot法检测ITGB4蛋白表达水平 取组织标本,剪碎研磨后加入600 μl组织裂解液裂解30 min,3 000 r/min离心10 min,取上清液。采用BCA法进行蛋白定量,在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白,100 ℃水浴5 min。经凝胶电泳、转膜、封闭后,予一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜;TBST洗膜3次,每次清洗时长5 min。二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。TBST洗膜3次,每次清洗时长5 min。DAB显色,以GAPDH为内参计算ITGB4蛋白的相对表达量。

1.6术后治疗 甲状腺乳头状癌患者术后需坚持服用甲状腺素制剂,以补充甲状腺素分泌的不足,防止甲状腺功能低下;同时还可通过反馈性抑制作用,减少促甲状腺素释放,降低肿瘤复发率。

1.7随访 通过门诊复查或电话等方式进行随访,随访截至2021年11月,观察患者术后复发情况及生存情况。以颈部出现淋巴结肿大、甲状腺部位出现小的结节、面部水肿、声音嘶哑等症状定义为复发。以出现复发或死亡定义为疾病进展。

2 结果

2.1ITGB4蛋白在不同组织中的表达水平比较 光镜下可见ITGB4蛋白主要表达于细胞质中。癌旁组织及结节性甲状腺肿组织细胞分布较为均匀,总体排列较为清晰。癌组织细胞呈现异常分布,排列不清晰。见图1。甲状腺乳头状癌组织ITGB4蛋白表达水平显著高于癌旁组织及结节性甲状腺肿组织(P<0.05),癌旁组织及结节性甲状腺肿组织ITGB4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2～3。

图1 免疫组化染色结果图(×400)

图2 Western blot实验结果图

F=18.093,P<0.001;*P<0.05

2.2ITGB4蛋白表达水平与老年甲状腺乳头状癌患者临床特征的关联性分析结果 ITGB4蛋白表达水平与患者TNM分期、淋巴结转移及分化程度存在显著关联性(P<0.05)。与TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期患者相比,Ⅲ～Ⅳ期患者ITGB4蛋白表达水平更高。与无淋巴结转移患者相比,发生淋巴结转移患者ITGB4蛋白表达水平更高。与高分化患者相比,中、低分化患者ITGB4蛋白表达水平更高,且低分化患者的表达水平较中分化患者更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ITGB4蛋白表达水平与老年甲状腺乳头状癌患者临床特征的关联性分析结果相对表达量]

2.3ITGB4蛋白表达水平与甲状腺乳头状癌患者预后的关联性分析结果 截至2021年11月,甲状腺乳头状癌患者中位随访时间为9个月,其中ITGB4高表达组失访3例。在随访期间,ITGB4低表达组死亡3例,高表达组死亡11例,低表达组生存预后情况优于高表达组(log-rank检验:χ2=5.175,P=0.023)。ITGB4低表达组进展5例,高表达组进展13例,低表达组无进展情况优于高表达组(log-rank:χ2=6.541,P=0.011)。见图4,5。

图4 ITGB4蛋白高表达组与低表达组生存曲线图

图5 ITGB4蛋白高表达组与低表达组无进展生存曲线图

3 讨论

3.1甲状腺癌是一种临床较为常见的内分泌恶性肿瘤,甲状腺癌分型中最为常见的类型为甲状腺乳头状癌,与其他恶性肿瘤相比,甲状腺乳头状癌恶性程度相对较低,预后较为理想[8-9]。但是也有研究表示,虽然甲状腺乳头状癌患者恶性程度较低,但患者若得不到及时有效的治疗,患者病情不断恶化,会出现被膜侵袭、颈淋巴结转移情况,严重威胁患者生命安全[10-11]。目前关于甲状腺乳头状癌的发病机制尚不明确,加强相关研究有助于开发新的治疗方法,改善患者预后[12-13]。

3.2恶性肿瘤的发生、发展与肿瘤组织细胞的增殖、扩散具有密切联系。ITGB4可通过胞外结构域和基质之间的相互作用转导信号,参与细胞的增殖、迁移、转化等生物学过程[14]。Sung等[15]研究结果显示,ITGB4能够通过偶联活化多种受体酪氨酸激酶及非受体酪氨酸激酶,参与BRAF/MEK/ERK等多条信号通路的调控,从而影响细胞增殖、凋亡与迁移等行为。有临床研究显示,ITGB4在前列腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中异常表达[6,16],但其与甲状腺乳头状癌的发生、发展关系还有待进一步研究。本研究结果显示,甲状腺乳头状癌组织中ITGB4的表达水平高于癌旁组织和结节性甲状腺肿,这与欧慧婷等[17]研究结果相似。分析其机制认为,肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管生成,其不仅为癌细胞生长提供营养,也为癌细胞转移提供通道;整合素即是介导细胞与细胞外基质、细胞间黏附作用的主要因子,其在肿瘤血管生成的过程中起着重要作用。

3.3甲状腺乳头状癌患者总体预后良好,但少数低分化、间变性或某些特殊组织类型的甲状腺乳头状癌患者预后较差,易复发、转移,易对放射性碘治疗产生抵抗性。甲状腺乳头状癌早期易发生颈部淋巴结转移,引起肿瘤复发,而一旦复发再次手术则相对困难,可能会增加手术并发症的发生风险,从而影响患者的生活质量,降低生存率[18]。本研究结果显示,Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的甲状腺乳头状癌组织中ITGB4表达水平更高。分析其主要机制为,ITGB4属于整合素家族的一种跨膜蛋白,生理状态下介导细胞与细胞外基质的黏附,在病理的状态下会促进甲状腺乳头状癌、鳞状细胞癌等多种肿瘤的侵袭、转移进程。有研究发现,ITGB4的表达水平与肿瘤TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移等密切相关,其高表达患者的预后更差,复发率更高[15]。本研究结果也显示ITGB4低表达的患者疾病进展风险更低、生存预后更好。结合既往研究结果,笔者认为ITGB4可能可以作为甲状腺乳头状癌的治疗靶点,并对患者的预后预测有重要的参考价值,值得进一步研究探讨。

综上所述,ITGB4蛋白在老年甲状腺乳头状癌组织中呈高表达,且与TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关,有助于临床医师对患者的预后情况进行评估。但本研究纳入样本量较少,结果可能存在一定偏倚,所得结论尚需通过多中心、大样本量的前瞻性研究来进一步验证。