海马钙蛋白与缺血性脑卒中相关研究

陈永智 朱丹

脑梗死又称缺血性脑卒中，是指各种脑血管病变所致脑部血液供应障碍，导致局部组织缺血、缺氧性坏死，而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。脑卒中是目前导致人类死亡的第二位原因，脑梗死是卒中最常见的类型，约占70%～80%[1]。脑卒中具有高发病率、高复发率、高致残率和高死亡率的特点。我国脑卒中现患人数高居世界首位，已成为导致成年居民死亡和残疾的首位病因，疾病负担沉重[2]。缺血性脑损伤的病理过程极为复杂，涉及中枢神经系统以及外周循环系统的多种细胞毒性因子和炎症细胞[3]。氧化应激和神经炎症是脑缺血再灌注损伤的关键病理过程，他们之间的密切互动介导了缺血性脑卒中期间的神经元损伤、血脑屏障损伤等[4]。急性脑缺血和脑损伤是由神经细胞内钙离子的兴奋性升高引起的，随后是复氧依赖的氧化应激、代谢衰竭和细胞死亡[5]。在细胞急性死亡中，过量的细胞内钙激活有害的磷脂酶、内切酶和钙蛋白酶，导致细胞器和细胞膜破裂，主要导致坏死性细胞死亡。而在细胞延迟性死亡中，最开始或较温和的兴奋性毒性可引发一系列细胞功能紊乱，如氧化应激、蛋白质合成或折叠障碍、线粒体功能障碍和细胞信号改变。这些紊乱的积累最终可导致细胞内钙离子的二次升高和细胞死亡途径的激活（细胞凋亡、坏死、自噬和坏死性凋亡），最终导致神经元的死亡[6]。海马钙蛋白（HPCA）是一种缓冲细胞内Ca2+和防止Ca2+引起细胞死亡的蛋白质，其与细胞内过量的Ca2+结合，在神经元的Ca2+排出中起着重要作用，进而帮助保护神经元免受兴奋性毒素损伤[7]。此外，HPCA 通过与神经细胞凋亡抑制蛋白（NAIP）相互作用，对Ca2+诱导的细胞死亡具有保护作用，从而保护受到缺血性损伤的大脑[8]。

1 谷氨酸兴奋性毒性与钙超载

细胞内游离钙浓度在脑内起着复杂的信号转导作用。Ca2+跨膜以及细胞内细胞器和细胞间质的流动整合了不同的细胞功能[9]。在缺血性脑损伤过程中，大脑的血液供应中断会导致氧气和葡萄糖缺乏，从而减少可用于支持脑细胞的能量[10]。这会导致神经元过度去极化，兴奋性神经递质（谷氨酸）的释放，谷氨酸蓄积导致突触后膜谷氨酸受体过度兴奋[11]。研究表明，谷氨酸受体家族的几乎所有成员都参与介导兴奋性毒性[12]，亲离子受体，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体（AMPAR）等被认为是特别重要的。由于兴奋性神经递质从细胞外间隙的重新摄取减少，大量Ca2+通过这些受体及其他方式进入细胞内，导致细胞内钙超载[13]。胞浆内Ca2+浓度的升高可引发一系列下游神经毒性级联反应，包括线粒体从ATP 合成过程中的电子传递解偶联，以及钙调蛋白酶和其他蛋白酶、蛋白激酶、一氧化氮合酶（NOS）、钙调神经磷酸酶和核酸内切酶等酶的激活和过度刺激，最终引发细胞凋亡和坏死[14]。

2 缺血性损伤与细胞凋亡

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种类型，当细胞处于压力或遭受不可逆的损伤时，涉及分解代谢酶的激活，信号级联反应破坏细胞成分[15]。在缺血性损伤发生时，细胞收到死亡信号，促凋亡蛋白移位到线粒体膜上，与其他促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad 和BCL-XS 相互作用。最终可以改变线粒体的通透性，触发细胞色素c 的释放，并与凋亡蛋白激活因子-1（APAF-1）结合形成凋亡体。细胞凋亡体的形成激活了半胱天冬酶原-9（proCaspase-9），使其激活成为半胱天冬酶-9（Caspase-9），最终触发核DNA 降解，从而引起细胞凋亡[16]。此外，配体（如FasL/TNF-α/TRAIL）与死亡受体结合，募集胞质适配蛋白分子，形成死亡诱导信号复合体（DISC），催化proCaspase-8 的分解和自催化激活，从而触发下游Caspase-3 的裂解，最终也导致细胞凋亡[17]。

3 HPCA 在缺血性损伤中的作用机制

3.1 HPCA 定义HPCA 是一种钙离子结合蛋白，属于神经元钙感受器家族，其参与了广泛的钙离子依赖的信号传递过程，包括离子通道的调制和运输、神经递质的释放、突触可塑性、细胞凋亡和基因表达的控制[18]。HPCA 具有3 个EF-Hand 结构（氨基酸序列折叠成一个螺旋-环形-螺旋模式）和1 个位于N 端的肉豆蔻酰化位点，主要在海马锥体层表达。该序列由195 个氨基酸残基组成，分子质量约为23kDa，与黏蛋白、恢复素、S-调制素、神经钙蛋白和神经黏蛋白样蛋白具有显著的同源性[19]。HPCA 在亚微摩尔浓度Ca2+水平上1mol 蛋白质结合3mol 的Ca2+，并以钙依赖的方式与质膜结合。HPCA 在其NH2 端的甘氨酸残基上发生肉豆蔻酰化，这种修饰是其膜结合特性的关键事件[20]。

3.2 HPCA 与兴奋性毒性损伤海马是大脑中最容易受到短暂性缺血和癫痫发作影响的区域，当其受到上述损伤时，细胞外兴奋性氨基酸（谷氨酸）水平会急剧升高[21]。持续暴露在兴奋性毒性损伤中，大量Ca2+通过谷氨酸受体等方式进入神经细胞中。一项在海马内注射喹啉酸对小鼠体内海马神经元影响的实验表明，HPCA 通过增加神经元中Ca2+的排出来保护海马神经元免受钙依赖性损伤[7]。也有研究表明，HPCA 可能以不同的方式解码谷氨酸受体的激活，将其转化为对其目标的特定位点和时间的修饰，以保护其免受兴奋性毒性损伤[22]。

3.3 HPCA 与细胞凋亡NAIP 通过第三个杆状病毒抑制重复结构域（BIR3）在Ca2+促进的相互作用中与HPCA 结合，可以在Caspase-3 激活和非激活途径中保护神经元免受钙诱导的细胞死亡。两者在神经细胞中的共同表达具有显著协同作用[23]。此外也有研究表明，HPCA 参与控制内质网中的Caspase-12 以及由其切割激活的下游通路。Caspase-12 在缺乏HPCA 的神经元中被激活，导致这些细胞抵抗细胞内Ca2+升高的脆弱性增加。同样Caspase-9 被发现在缺乏海马钙素的神经元中被加工[24]，而这些Caspase 在细胞凋亡中起重要作用。

4 HPCA 与相关药物研究进展

目前为止，许多药物被证明可以通过影响HPCA 的表达，从而在大脑受到缺血性损伤时保护神经元。首先，褪黑素是一种强大的自由基清除剂和抗氧化剂[25]，由松果体中的L-色氨酸产生[26]。褪黑素可防止氧化应激引起的钙超载和线粒体膜去极化，阻断Caspase-3 的激活，从而阻止细胞凋亡[27]。此外褪黑素可调节缺血性脑损伤中小白蛋白和HPCA 的表达，从而参与细胞内钙水平的调节[28]，在缺血性脑损伤中起到神经保护作用。银杏叶提取物EGB761 主要由黄酮苷和独特的萜类内酯组成，在缺血的大脑中表现出抗氧化性能[29]。有研究表明，EGB761 可以减轻脑缺血损伤引起的HPCA 的减少。从而可减轻谷氨酸暴露引起的细胞内Ca2+浓度的升高，因此HPCA 维持参与了EGB的神经保护作用[30]。阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）是一种酚类化合物和有效的抗氧化剂，具有较强的抗炎活性[31]。同样，阿魏酸被证实在缺血条件下，维持神经元细胞中HPCA 的表达，阻止了谷氨酸诱导的HPCA 表达下降[32]。而烟酰胺、雌激素、槲皮素同样在实验中被证明可降低大脑中动脉大鼠模型的梗死体积，调节缺血性脑损伤中HPCA的表达，从而调节细胞内钙水平[33～35]。分子氢作为一种新的抗氧化剂，可以选择性地减少.OH 和ONOO-而不影响生理活性氧。研究表明，富氢水（HRW）可以减弱活性氧的过度产生，保护神经元免受氧化应激[36]，并可以通过调节缺血性脑损伤中钙缓冲蛋白（特别是小白蛋白和HPCA）的表达来保护神经元，从而维持细胞内Ca2+水平的稳态[37]。7，8-二羟基-4-甲基香豆素（Dhmc）是一种香豆素衍生物，具有特别强的自由基清除能力[38]。Dhmc 抑制谷氨酸诱导的HPCA 的耗竭，通过清除自由基和调节HPCA 表达来预防谷氨酸诱导的毒性[39]，从而保护神经元免受缺血性损伤。现如今越来越多的药物被证实通过与HPCA 的相互作用显示出保护神经细胞的作用，对该类药物保护机制的深入研究可为神经系统疾病提供新的治疗策略及药物研究靶点。

5 总结

HPCA 是一种钙结合蛋白，其在钙超载及谷氨酸诱导的Ca2+水平增加的调节中起到重要作用，同时其与神经细胞凋亡抑制蛋白的相互作用在缺血性损伤中起到保护神经元的作用，以上机制为药物的研发起到了指导作用。然而，基于目前对缺血性脑卒中发生后神经元损伤和修复的过程认识不够完善，需要进一步研究以明确HPCA 的表达在脑卒中发作前后如何实现脑保护。了解其在氧化损伤、兴奋性毒性、钙超载中的分子机制，可以为神经元保护提供潜在的治疗依据。如何降低缺血性损伤时细胞内Ca2+水平或可成为缺血性脑卒中治疗的重要方向。进一步了解HPCA 在缺血性脑卒中发生后Ca2+水平的调节作用及相关机制，为缺血性脑卒中治疗的有效性及安全性提供更多新策略。