LINC02802 在肝癌中的表达及与预后和免疫细胞浸润的关系

郎亚昆 范钰 范廷璐

肝癌是最常见的六种恶性肿瘤之一，也是全世界癌症相关死亡的第二大原因[1]。由于其缺乏高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物，且转移率高，导致预后欠佳[2]。所以，寻找肝癌相关的潜在生物标志物对肝癌的诊断和治疗异常重要。研究表明长链非编码RNA（lncRNA）参与增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为[3]。lncRNA 在如肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等的发生中均有参与[4]。癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）数据集的生物信息学分析已被证明是一种寻找多种恶性肿瘤诊断和预后标志物的新工具[5，6]。因此，本研究通过对TCGA 数据库的数据进行挖掘，研究LINC02802 的表达水平在肝癌中的价值，探索LINC02802 表达水平与肝癌预后的关系，为进一步研究肝癌的发生发展提供依据。此外，我们分析了LINC02802 的表达与免疫细胞浸润的相关性，为筛选免疫治疗潜在获益人群提供新思路。

1 材料与方法

1.1 数据收集通过TCGA 数据库收集424 例肿瘤组织和正常组织中LINC02802 表达水平，分析LINC02802 表达差异。

1.2 LINC02802 的表达与临床病理学特征及预后相关性分析在TCGA 数据集中搜集到原始研究总样本数为424 例，包括肝癌组织374 例，正常组织50 例，以LINC02802 表达量的中位数为界，分为高表达组和低表达组，进一步分析LINC02802 表达量与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系。

1.3 LINC02802 表达与免疫细胞浸润相关性分析采用R 软件“GSVA”包对TCGA 数据库肝癌TPM数据进行单样本基因集富集分析（ssGSEA）[7]，得到免疫细胞类型评分，ssGSEA 免疫细胞类型的标记基因依据Bindea 等[8]的研究，评估肿瘤中的免疫细胞浸润水平。然后进行Spearman 秩相关分析来检测LINC02802 表达量与相应免疫细胞浸润水平之间的关系。

1.4 统计学方法应用R（v.3.6.3）软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk normality test 对数据正态性进行检验，对服从正态分布的计量资料，组间比较采用t检验，否则应用Mann-Whitney U 或Wilcoxon 符号秩检验，计数资料比较采用χ2检验或Fisher 检验。用Kaplan-Meier 法行生存分析，多因素分析采用Cox 回归模型。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 肝癌组织和正常组织中LINC02802 的表达差异通过TCGA 分析样本424 例，包括肝癌组织374 例，正常组织50 例。非配对分析中374 例肝癌组织中LINC02802 的表达量为0.621±0.699，50 例正常组织中LINC02802 的表达量为0.115±0.119，两组比较差异有统计学意义（P<0.001）（见图1A）。配对分析中50 例正常组织中LINC02802 的表达量为0.115±0.119，50 例肝癌组织中LINC02802 的表达量为0.406±0.329，两组比较差异有统计学意义（P<0.001）（见图1B）。相对于正常组织，LINC02802在肝癌组织中的表达量显著增高。以正常组织为对照，做ROC 曲线，结果显示AUC 为0.835，截尾值为0.165，敏感度和特异性分别为78.0%和78.3%（见图1C）。

图1 LINC02802 在肝癌组织及正常组织中的表达

2.2 LINC02802 的表达与肝癌患者临床病理特征的关系将374 例肝癌患者以LINC02802 在肝癌组织中表达量的中位数为界值分为两组，包括187 例低表达患者和187 例高表达患者。对LINC02802的表达与肝癌临床病理特征进行分析，结果显示LINC02802 的表达与组织学分级、血管浸润及甲胎蛋白水平相关（P<0.05），见表1。

表1 LINC02802表达与肝癌患者临床病理特征的关系[n（%）]

2.3 LINC02802 对肝癌患者预后的影响Kaplan-Meier 分析显示LINC02802 表达量与肝癌患者总生存期明显相关，与低表达患者相比，高表达患者的总生存期差（P=0.007）（见图2）。单因素分析显示，肝癌患者的T分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表达量与预后有关。多因素Cox 回归分析显示，LINC02802 表达量是肝癌患者的独立预后影响因素，且LINC02802 高表达患者的死亡风险是低表达患者的1.634 倍。见表2、3。

表2 肝癌患者预后单因素Cox 回归分析

表3 肝癌患者预后多因素Cox 回归分析

图2 LINC02802 高、低表达肝癌患者总生存期曲线

2.4 LINC02802 表达与免疫浸润细胞表面标记物的相关性分析为了确定LINC02802 表达对肝癌的影响是否与肿瘤免疫细胞浸润有关，我们基于TCGA 数据库中424 例肝癌患者的TPM 数据，采用ssGSEA 评估了免疫细胞浸润和LINC02802 表达量之间的关系。Spearman 相关分析显示，LINC02802的表达与NK CD56bright 细胞、Th2 细胞、TFH 细胞、巨噬细胞、T helper 细胞、aDC 细胞、iDC 细胞呈正相关（P<0.05），其中NK CD56bright 细胞、Th2 细胞、TFH 细胞是与LINC02802 表达呈正相关的前三种免疫细胞。LINC02802 的表达与Th17 细胞、中性粒细胞、Tcm 细胞、NK 细胞的浸润呈负相关（P<0.05）。见图3、表4。

表4 TCGA 数据库分析LINC02802 与免疫浸润细胞表面标记物的相关性

图3 LINC02802 表达与免疫细胞浸润水平关系

3 讨论

肝癌是一种死亡率很高的常见恶性肿瘤[9]。近年来，越来越多的证据表明，异常lncRNA 参与了肝癌的发生和发展[10～13]。lncRNA 是一种长度超过200 个核苷酸的非编码RNA[14]。多项研究发现，lncRNA 通过不同机制在调控基因表达中发挥重要作用，如染色质修饰、转录和转录后加工等[15～17]。因此，lncRNAs 作为新的肿瘤标志物和治疗目标具有很大的潜力。

本研究中，我们在TCGA 数据库中发现了肿瘤相关分子LINC02802 在包括肝癌在内的多种肿瘤中都有不同程度的表达，然而目前关于LINC02802的研究较少。我们通过TCGA 数据库收集了肝癌患者的临床病理特征和LINC02802 基因表达的相关数据，发现在肝癌组织中LINC02802 的表达水平明显高于正常组织（P<0.001），提示LINC02802 可能是预测和治疗肝癌潜在的靶点及肿瘤标志物。进一步分析LINC02802 的表达与肝癌临床病理特征关系，提示其与组织学分级、血管浸润及甲胎蛋白水平相关（P<0.05）。通过单因素分析发现患者的T 分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表达与肝癌患者生存相关（P<0.05）。多因素Cox 回归分析显示，患者的LINC02802 表达量是肝癌患者预后的独立影响因素，LINC02802 高表达患者的死亡风险是低表达患者的1.634 倍。

近年来，研究表明，肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互影响在肿瘤发生发展过程中起着关键作用，同时对免疫治疗的疗效也有重要影响[18～20]。本研究分析了LINC02802 表达量与相应免疫细胞浸润水平之间的关系，结果显示，LINC02802 的表达量与NK CD56bright 细胞、Th2 细胞、TFH 细胞、巨噬细胞、T helper 细胞等的浸润水平呈正相关，与Th17 细胞、中性粒细胞、Tcm 细胞等的浸润水平呈负相关。

综上所述，LINC02802 的表达与肝癌的预后不良呈正相关，且与免疫细胞浸润水平有关，为肝癌的诊断和预后提供新的生物标志物，同时对免疫治疗具有重要意义。虽然本研究使用生物信息学工具对LINC02802 在肝癌中的作用进行探索，但尚存在不足，需要大量基础实验对本研究的预测结果进行验证并探讨其作用机制。