中性粒细胞胞外诱捕网在动脉粥样硬化中的研究进展*

杜高辉, 张 青, 魏宇淼

华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,武汉 430022

动脉粥样硬化是由脂质驱动,多种细胞共同参与的血管慢性炎症性疾病,主要发生于大中动脉,是缺血性心脏病和中风的主要原因[1]。动脉粥样硬化早期,氧化脂质损害并激活内皮细胞,造成内皮功能障碍,是动脉粥样硬化病变的起始环节。随后循环中的单核细胞、巨噬细胞进入内皮下,进一步分化为泡沫细胞,加速斑块脂质核心的形成和扩张,与平滑肌细胞及其分泌物形成的纤维帽共同构成动脉粥样硬化的标志性病变。近年,中性粒细胞,特别是中性粒细胞形成的胞外诱捕网(neutrophil extracellular trapping nets,NETs)被认为是动脉粥样硬化病程进展的重要参与者。NETs直接损伤内皮细胞和平滑肌细胞,招募循环中的单核细胞和中性粒细胞等其它免疫细胞,加重动脉粥样硬化病变的炎症反应,导致斑块坏死核心扩大和斑块不稳定性增加,严重威胁人体健康[2]。本文从NETs产生,NETs与内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞以及其他细胞的相互作用出发,阐明NETs对动脉粥样硬化病程进展的关键作用,为动脉粥样硬化的研究提供新的思路。

1 NETs概述

1.1 NETs的发现

中性粒细胞是机体固有免疫的主力军,机体受到炎症刺激时,中性粒细胞从循环中迁移至感染部位结合并吞噬病原体,通过脱颗粒释放抗菌因子抵御病原体,并通过抗微生物蛋白、释放活性氧迅速杀死病原体。Brinkmann等[3]于2004年首次发现并描述了NETs。它由活化的中性粒细胞产生,其主要成分包括核染色质、组蛋白和颗粒蛋白,如髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和肽基精氨酸脱亚胺酶Ⅳ(peptidearginine deaminase 4,PAD4)等。核染色质由核酸和蛋白质组成,作为NETs的骨架,组蛋白起到促进微生物和病原体粘附的作用。颗粒蛋白中的MPO、NE等发挥消灭病原体的作用。NETs最早被认为是打击入侵病原体(主要为细菌)的一个重要工具[4]。随后的研究发现,NETs对细菌毒素、原生生物和病毒也有抵御作用。此外,越来越多的证据表明,NETs在多种疾病中都发挥作用,如自身免疫性疾病[5]、肿瘤[6]、糖尿病[7]、阿尔兹海默病[8]等。同样的,NETs与动脉粥样硬化的病理生理进展也息息相关[9]。

1.2 NETs产生的机制

NETs产生的过程称为NETosis[3],包括NETs的生成和释放。目前的研究认为NETs的产生有两种不同的机制,分别为:自杀性NETosis(核膜裂解NETs形成)和非自杀性NETosis(囊泡介导的NETs形成)。自杀性NETosis是一种进展缓慢(持续数小时)的细胞死亡方式,有别于坏死和凋亡[10]。目前关于自杀性NETosis的机制研究表明,中性粒细胞通过佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理而被激活,随后通过上调糖酵解途径,诱导激活细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),继而诱导NADPH氧化酶复合物的磷酸化和组装。NADPH氧化酶调节活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生[11],提高Ca2+水平,进一步激活PAD4。PAD4则通过将组蛋白H3和H4的精氨酸转化为瓜氨酸,使组蛋白丢失大量阳离子,发生染色质凝集[12]。同时,ROS的大量产生会破坏中性粒细胞颗粒膜和溶酶体膜,诱导释放MPO和NE。NE可以将GSDMD(gasdermin D)转化为活性形式GSDMD-NT,介导核膜、颗粒膜、质膜孔隙的形成。在此过程中,颗粒蛋白被转移至细胞核中,参与染色质的去折叠。随后核膜破裂,染色质与细胞质蛋白混合,进入细胞外液[13]。

自杀性NETosis形成的时间主要在刺激后3～4 h,而中性粒细胞也可以通过非常快的速度(5～60 min)释放NETs,且不依赖于细胞死亡,即非自杀性NETosis。目前的研究认为非自杀性NETosis在调节病原体感染方面发挥更重要的作用,中性粒细胞通过Toll样受体2(Toll-like repetor 2,TLR2)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和补体受体识别不同刺激物诱导NETs产生,与NADPH氧化酶激活无关[13]。如金黄色葡萄球菌和白色念珠菌分别激活TLR2和补体受体,大肠埃希菌和脂多糖激活的血小板则激活TLR4。Toll样受体和补体受体激活PAD4,使得NE向细胞核移位,参与染色质去凝集,随后蛋白质修饰的染色质通过小泡排出而不破坏细胞膜。不同于自杀性NETosis,非自杀性NETosis在NETs释放后,中性粒细胞仍然可以存活并发挥进一步功能。

1.3 NETs的检测

基于NETs的组成成分,研究者使用多种检测方法对不同部位的NETs进行识别和定量。Perdomo等[14]通过荧光光谱法和酶联免疫吸附法检测和定量血清中的游离DNA(circulating-free DNA,cfDNA)和NETs中的瓜氨酸化组蛋白H3(cit-H3)、NE、MPO等组分。Gavillet等[15]使用抗瓜氨酸化组蛋白抗体和抗MPO抗体结合DNA染料,通过流式细胞术识别和量化人或小鼠血液样本中的NETs。Zhao等[16]使用一种新的方法,通过结合流式细胞术与荧光显微镜区分并量化自杀性NETosis和非自杀性NETosis。电子显微镜技术可以检测NETs的形态和结构,如通过扫描电镜(SEM)可以观察NETs的超微结构,而通过透射电镜(TEM)观察细胞释放NETs的过程,例如核膜裂解,并且区分细胞坏死、细胞凋亡、NETosis[10]。在小鼠实验性结肠炎模型中,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色可以检测到结肠组织中NETs的组分,如PAD4、MPO、NE、cit-H3较对照组表达量升高[17]。活体显微镜技术是实时检测NETs产生的方法之一。Bruns等[18]在小鼠烟曲霉感染模型中使用双光子显微镜进行实时成像,检测到NETs的产生及抵御烟曲霉感染的过程,并使用中性粒细胞耗竭抗体证明此过程需要中性粒细胞的参与。

2 NETs与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是由脂质驱动,多种细胞(如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和其它免疫细胞)共同参与的慢性动脉炎症性疾病。众多研究表明,中性粒细胞和NETs在动脉粥样硬化疾病进展中发挥作用。Megens等[19]首次报道NETs存在于人和小鼠的动脉粥样硬化病变处。Pertiwi等[20]的研究则通过对44个复杂斑块(包括斑块内出血、糜烂、破裂)和20个完整斑块进行免疫组织化学染色,揭示不同形态斑块的中性粒细胞和NETs分布情况。结果显示,完整斑块中无NETs,但其周围血管组织分布有大量中性粒细胞和NETs。而在复杂斑块(如斑块内出血、糜烂和破裂等)中,中性粒细胞和NETs则广泛存在,且在不同复杂斑块间分布无明显差异。另一项关于人类颈动脉内膜标本的研究表明,与富含脂质的不稳定斑块相比,侵蚀斑块表面分布有大量中性粒细胞和NETs,并且与内皮细胞凋亡数量相关[21]。NETs也广泛分布于小鼠动脉粥样硬化病变部位。NE和蛋白酶3(PR3)是NETs发挥生物学功能的重要工具。Warnatsch等[22]的研究表明,与对照组ApoE基因敲除小鼠相比,ApoE/NE/PR3基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块面积减少约3成。给予ApoE基因敲除小鼠脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)治疗,其斑块面积同样减少约3成,但给予ApoE/NE/PR3基因敲除小鼠DNase治疗,斑块面积几乎不发生改变。这些研究证明了NETs在动脉粥样硬化中的重要作用。动脉粥样硬化的危险因素也会诱导NETs的产生,如斑块中的oxLDL、胆固醇结晶、氧化甾醇、血小板和各种趋化因子等等。研究表明oxLDL以浓度和时间依赖的方式,增加活性氧的产生,并且通过TLR2和TLR6途径来诱导NETs的产生[23]。另一项研究表明,oxLDL可以增加PMA处理后中性粒细胞NETs的产生,并增加NETs中MPO的释放[24]。氧化磷脂也在NETs形成中发挥重要作用,如给予LNK基因敲除小鼠ox-PL抗体不仅可以减少血清oxPL水平,还会减少NETs和动脉血栓形成[25]。同时,中性粒细胞自身胆固醇过度积累也会影响NETs的形成。如骨髓细胞中ABCA1/ABCG1缺乏(ABCA1/ABCG1介导胆固醇流出至高密度脂蛋白HDL)会导致单核/巨噬细胞以及中性粒细胞过量胆固醇积累,激活NLRP3炎症小体,导致动脉病变部位中性粒细胞的浸润和NETs的释放[26]。Curcic等[27]发现分泌性磷脂酶A2修饰的HDL可以抑制中性粒细胞的活化,以及NETs的形成,原因可能是sPLA2修饰的HDL,其胆固醇外流能力增强或是抑制中性粒细胞内Ca2+的升高。总而言之,NETs与动脉粥样硬化的关系存在复杂性和多样性,NETs不仅在动脉粥样硬化斑块处广泛分布,还与动脉粥样硬化相关细胞相互作用。

2.1 NETs与内皮细胞

内皮功能障碍是动脉粥样硬化病变早期的标志性事件。NETs起始于血流紊乱和剪切应力增强的部位,可以直接激活和损伤内皮细胞,导致内皮功能障碍[28]。Carmona-Rivera等[29]发现NETs中存在的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)与内皮细胞中MMP-2的激活和内皮功能障碍密切相关,抑制MMP-2的激活可以恢复内皮功能,减轻NETs引起的血管毒性。同时,NETs也通过IL-1α和组织蛋白酶G的协同作用激活内皮细胞,促进凝血。NETs会进一步放大和加重侵蚀斑块血栓并发症引起的内皮功能障碍。而内皮细胞的损伤和激活会进一步诱导NETs和网状中性粒细胞的产生,二者的相互作用形成一系列恶性循环,加重内皮功能障碍[30]。因此,减少NETs产生可以改善内皮细胞功能,预防早期动脉粥样硬化病变进展。

2.2 NETs与平滑肌细胞

中性粒细胞和NETs会优先聚集在平滑肌细胞富集的粥样斑块中,通过TLR2依赖的途径诱导氧化应激和内皮细胞凋亡,导致侵蚀斑块的形成[31]。通过对355例颈动脉斑块进行中性粒细胞标记CD66b染色发现[32],与其余斑块相比,中性粒细胞富集的斑块,其脂质核心更大,巨噬细胞数量更多,相反胶原纤维和平滑肌细胞数量则较之减少。同时中性粒细胞数量与斑块内炎症因子IL-8,以及MMP-8、MMP-9水平呈正相关。PAD4是NETs形成的关键分子,也与侵蚀斑块形成密切相关。Knight等[33]通过氯脒抑制PAD4从而减少NETs形成,减轻动脉粥样硬化斑块的病变面积,进一步表明NETs在动脉粥样硬化中的重要作用。在动脉粥样硬化小鼠中,斑块内激活的平滑肌细胞诱导中性粒细胞的迁移并释放NETs。NETs中的组蛋白H4则可结合并溶解平滑肌细胞[34]。斑块内平滑肌细胞的死亡会减少间质胶原合成,导致纤维帽变薄,斑块不稳定性增加。使用抗组蛋白H4抗体抑制这一反应后,起到减小斑块面积,增加斑块稳定性的作用。

2.3 NETs与巨噬细胞

巨噬细胞与中性粒细胞相互作用会加重斑块内的炎症反应。如胆固醇结晶激活中性粒细胞后,促进巨噬细胞合成IL-1β的前体分子,同时巨噬细胞吞噬胆固醇结晶,促进IL-1β成熟,进一步上调T细胞促炎因子IL-17的表达,IL-17则会进一步招募免疫细胞至动脉粥样硬化病变部位,加速动脉粥样硬化的发展[22]。此外,NETs通过巨噬细胞的TLR9/NF-κB通路,介导IL-8的释放。反之,IL-8通过其受体CXC受体2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)介导NETs的形成[35]。Josefs等[36]发现,糖尿病LDLR基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变部位NETs数量增加,诱导病变部位巨噬细胞向M1型极化。给予糖尿病LDLR基因敲除小鼠DNase治疗后,NETs诱导的巨噬细胞炎症减轻,斑块面积、坏死核心及胆固醇结晶也相应减少。

2.4 NETs与DC细胞

NETs不仅与巨噬细胞相互作用,与DC细胞之间联系亦十分紧密。研究表明,NETs通过激活浆细胞样树突状细胞的自身免疫反应致动脉粥样硬化[37],即NETs或死亡细胞产生的DNA与中性粒细胞产生的颗粒蛋白共同激活血管壁中的浆细胞样树突状细胞,引发强烈的Ⅰ型干扰素反应,导致动脉粥样硬化的发生。反之,浆细胞样树突状细胞的缺失则会减轻斑块负荷及Ⅰ型干扰素反应[38]。Knight等[33]的研究表明,NETs促进浆细胞样树突状细胞活化,产生干扰素α促进血管损伤、血栓和动脉粥样硬化斑块的形成。抑制PAD4可消除NETs释放,减轻Ⅰ型干扰素反应,并减少动脉粥样硬化病变血管中膜和外膜网状中性粒细胞的数量。

2.5 NETs与血小板

Clark等[39]于2007年首次报道血小板参与NETs的形成。在小鼠脓毒血症模型中,LPS通过结合血小板表面TLR4,促使血小板与中性粒细胞结合,导致中性粒细胞快速活化和NETs产生。血小板和中性粒细胞也通过p-选择素(p-selectin)和白细胞表面受体p-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)相互作用[40]。此外,血小板糖蛋白(GP)Ⅰb与中性粒细胞β2整合素(CD18)结合也参与二者的相互作用。研究表明,阻断中性粒细胞β2整合素(CD18)可以显著减少血小板活化介导的NETs生成[41]。血小板活化对于中性粒细胞NETs的产生至关重要,其活化后分泌的蛋白或细胞因子可以直接参与中性粒细胞NETs的形成。如血小板活化后释放高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1),诱导中性粒细胞的自噬反应并加速NETs的产生[42]。血小板因子4(platelet factor 4,PF4)则参与炎症部位中性粒细胞的募集和其DNA的释放。体外研究表明,通过抑制PF4可减少中性粒细胞DNA的释放,相反,重组PF4则促进NETs的形成[41]。

3 小结与展望

中性粒细胞作为先天免疫系统的重要组成部分,在感染性疾病和炎症性疾病中发挥重要作用。动脉粥样硬化斑块表面NETs的形成和释放会不断侵蚀斑块,诱导斑块内皮细胞凋亡及斑块表面血栓形成。NETs也会加重斑块的炎症反应、增加斑块内脂质负荷和胆固醇坏死结晶数量,并加速平滑肌细胞死亡,导致胶原纤维合成减少,纤维帽变薄及斑块不稳定性增加。总而言之,NETs在动脉粥样硬化斑块的形成和发展中的作用不容忽视。关于NETs和动脉粥样硬化的关系还需要更加深入和细致的研究,从而为后续的治疗和药物研发起到指导作用。