超声波—发酵辅助提取玉竹黄酮的研究

李志清 王殿奎 张李莉 蒋晓蕊 孙 琛 孙金旭

（1 衡水市综合检验检测中心 河北 衡水 053000；2 衡水市质量与标准化研究院 河北 衡水 053000； 3 衡水学院 河北 衡水 053000）

玉竹为多年生草本植物，百合科黄精属，2002 年3 月被国家卫生部列为药食同源植物，其入药部位为根茎，经研究其活性成分为黄酮、多糖、糖蛋白、皂甙等，目前已经报道的玉竹活性成分的功效有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等[1～2]。

超声波辅助提取具有省事、省力、高效、环保的特点，在现代提取技术中应用广泛[3]；发酵提取法利用的是菌发酵过程中产生的多种代谢产物和酶系对植物细胞壁破坏效果明显的特点[4]。本文研究超声波—发酵辅助提取玉竹活性物质黄酮优化提取工艺，为玉竹黄酮工业化提取提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料。玉竹(购自北京同仁堂衡水分店)，芦丁标准品(购于国家标准物质网)，菌种(衡水学院生命科学系菌种室保藏)。

1.2 仪器设备。破壁机(深圳市净品环保科技有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，分光光度计(722G 可见分光光度计，广州广一科学仪器有限公司)，超声波提取仪(MHY-25045，北京美华仪科技有限公司)。

1.3 黄酮提取方法

1.3.1 普通提取法。玉竹破壁机粉碎后，过60 目筛，按照1∶5 的料液比例进行配比，混匀后，逐渐加热升温至80 ℃，保温提取2 h。

1.3.2 超声提取法。玉竹破壁机粉碎后，过60 目筛，按照1∶5 的料液比例进行配比，混匀后，进行超声提取，提取功率200 W，时间15 min。

1.3.3 发酵提取法。玉竹破壁机粉碎后，过60 目筛，按照1∶5 的料液比例进行配比，混匀后，按1%添加葡萄糖，煮沸灭菌20min，接种按工艺接种目标菌发酵培养。

1.3.4 超声—发酵辅助提取法。玉竹破壁机粉碎后，过60 目筛，按照1∶5 的料液比例进行配比，混匀后，按1%添加葡萄糖，进行超声提取，提取功率200 W，时间15 min，煮沸灭菌20 min，接种按工艺接种目标菌发酵培养。

2 结果与分析

2.1 超声波—发酵辅助提取玉竹黄酮发酵菌种的选择。经粉碎处理后的玉竹，按照1∶15 的料液比例配成浑浊液，超声提取20 min 后，分装于4 个1 L 的三角瓶中，每个瓶中装液量600 ml，灭菌20 min 后，冷却至室温，分别无菌接种枯草芽孢杆菌、酵母菌、保加利亚乳杆菌、木醋杆菌，活化后菌液接种量占料液体积的1%，分别发酵培养36 h，发酵结束后过滤取液体，测定黄酮提取量，结果如图1 所示。由图1 可知，虽然相对于普通提取和超声提取，各菌株发酵后对玉竹黄酮的提取都有不同程度的提高，但相对来说枯草芽孢杆菌发酵下，玉竹黄酮提取量最高，因此选择枯草芽孢杆菌作为超声—发酵辅助提取玉竹黄

图1 超声波— 发酵辅助提取菌种选择

酮的发酵菌株。

2.2 接种量对超声—发酵辅助提取玉竹黄酮的影响。经超声处理后的玉竹，分别分装于8 个1 L 的三角瓶中，装液量600 ml，灭菌冷却至室温，按照不同接种量无菌接种经活化好的枯草芽孢杆菌，发酵36 h 后，测定玉竹黄酮提取量。由图2 可知，枯草芽孢杆菌接种量对玉竹黄酮提取量有一定的影响，低比例接种量条件下，玉竹黄酮提取量较低，随着接种量的增大，玉竹黄酮提取量随之增加，枯草芽孢杆菌接种量为2.5%时，玉竹黄酮提取量最高，之后随着接种量的增加，玉竹黄酮提取量呈现降低的趋势，因此，确定接种量为2.5%较为适宜。

图2 接种量对超声— 发酵辅助提取的影响

2.3 发酵温度对超声—发酵辅助玉竹黄酮提取量的影响。经超声处理后的玉竹，分装于6 个1 L 的大三角瓶中，装液量600 ml，灭菌后冷却至室温，按照2.5%的比例无菌接种，分别在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃下发酵培养36 h，之后过滤出液体，测定玉竹黄酮提取量。由图3 可知，不同发酵温度下，枯草芽孢杆菌对玉竹黄酮提取量不同，低温不利于玉竹黄酮的提取，随发酵温度的提高，玉竹黄酮提取量增加，当发酵温度为28 ℃时，玉竹黄酮提取量最高，之后随温度升高，玉竹黄酮提取量降低，分析原因可能是28 ℃为该培养条件下枯草芽孢杆菌的适宜发酵生长温度，菌体大量快速地繁殖后，代谢产物增多，产生的酶等物质丰富，有利于破壁，因此确定28 ℃为发酵提取温度。

图3 发酵温度对玉竹黄酮提取量的影响

2.4 发酵时间对超声—发酵辅助玉竹黄酮提取量的影响。经超声处理好的玉竹黄酮，装于3 L 的三角瓶中，装液量1.8 L，灭菌后，冷却至28 ℃，按2.5%的接种量无菌接种枯草芽孢杆菌，发酵培养，每8 h 取样测定玉竹黄酮提取量。由图4 可知，玉竹黄酮提取量随发酵时间的增加而增大，这也与枯草芽孢杆菌的生产繁殖有关，培养到48 h，玉竹黄酮提取量最高，之后降低，表明48 h 菌体生长繁殖达到最旺盛期，代谢产物及酶系最为丰富，破壁效果最好。

图4 发酵时间对玉竹 黄酮的影响

2.5 几种玉竹黄酮提取方法对比分析。根据玉竹黄酮提取量，对比分析普通提取、超声提取、发酵提取、超声—发酵辅助提取玉竹黄酮方法，发现超声—发酵辅助提取＞发酵提取＞超声提取＞普通提取，优化后测得超声—发酵辅助提取玉竹黄酮提取量达到47.29 mg/g，相对于普通热水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相对于发酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相对于超声提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超声—发酵辅助提取玉竹黄酮是非常行之有效的方法。

图5 不同提取方式对比分析

3 结论与讨论

利用超声波—发酵辅助提取玉竹黄酮，对菌种、接种量、发酵温度、发酵时间等工艺参数进行优化，优化后的超声波—发酵辅助提取玉竹黄酮的工艺条件为：玉竹浑浊液先进行超声处理再进行发酵，发酵菌种为枯草芽孢杆菌，发酵温度28 ℃，接种量2.5%，发酵时间48 h，此条件下，玉竹黄酮提取量达到47.29 mg/g，相对于普通热水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相对于发酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相对于超声提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超声—发酵辅助提取玉竹黄酮是非常行之有效的方法。