电针对青春期多囊卵巢综合征大鼠下丘脑和卵巢组织中性激素受体表达的影响※

杨 立,王 志,董浩旭,刘艳娟,黄冬梅

(华中科技大学同济医学院附属同济医院,湖北 武汉 430000)

多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是常见的女性生殖内分泌疾病,以月经稀发、高雄激素血症、高胰岛素血症、持续无排卵和卵巢多囊样化为特征。研究表明,PCOS与高雄激素血症、高胰岛素血症和胰岛素抵抗(IR)、下丘脑-垂体-卵巢轴功能障碍有关[1-4]。多数女性在青春期时就已出现高雄激素血症、胰岛素抵抗和肥胖等倾向,部分甚至在此期即被确诊为PCOS[4-6]。由于青春期女性的生殖、内分泌系统尚处于可塑造阶段,若在此阶段尽早干预,则有可能在青春期实现对PCOS的改善甚至逆转。目前,临床治疗PCOS以调整月经周期及药物促排卵等对症治疗为主[7]。

研究表明,针灸是治疗PCOS女性生殖内分泌功能障碍的一种安全有效的方法[8]。临床研究发现,针灸可提高PCOS患者的排卵率和妊娠率,调整月经周期,降低黄体生成素(LH)、LH/卵泡刺激素(FSH)比值、睾酮、空腹胰岛素水平等[9]。本团队前期研究发现,电针可改善青春期PCOS大鼠的动情周期、卵巢形态和异常的神经内分泌,其作用机制与改变下丘脑Kisspeptin表达和促性腺激素释放激素(GnRH)释放有关[10]。基于此,本研究通过建立青春期PCOS大鼠模型,观察电针对青春期PCOS大鼠下丘脑和卵巢组织中雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)表达的影响,旨在进一步探究电针改善青春期PCOS神经内分泌异常的分子机制,现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 选取清洁级(SPF)SD 大鼠14只[动物许可证号:SCXK(京)2016-0006],包括雌性大鼠10 只(体质量250g左右)及雄性大鼠4只(体质量280g左右),均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 药物 双氢睾酮(DHT)(货号:SZBD263XV),由德国Sigma公司提供。

1.3 试剂与仪器 AR(货号:A16200)、孕激素受体(PR)(货号:A0321)、ER(货号:A16668)抗体均购于中国武汉爱博泰克生物科技有限公司;RIPA 裂解液(强)(货号:G2002-100)、BCA 蛋白定量试剂盒(货号:G2026)、十二烷基硫酸钠(SDS)(货号:G5037)、SDSPAGE凝胶制备试剂(货号:G2003)、5×蛋白上样缓冲液(货号:G2013)、TBST 缓冲液(货号:G0001)、吐温-20(货号:WGT8220)、甘氨酸(货号:G5010)、三羟甲基氨基甲烷(货号:G5009)、二抗稀释液(货号:G2009)、一抗稀释液(货号:G2025)、脱脂奶粉(货号:G5002)、二抗(货号:926-32111)、PBS 缓冲液(货号:G0002-2L)、戊巴比妥(货号:G5003)、4%多聚甲醛固定液(货号:G1101-500ML)均购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司;针灸针(规格:0.16mm×25mm)购于无锡佳健医疗器械股份有限公司;电针仪(型号:AS-SUPER4S)购于德国Schwa-Medico公司;台式高速离心机(型号:BDF-1600)购于北京市六一仪器厂。

2 实验方法

2.1 分组与模型制备 青春期PCOS大鼠模型采用出生前雄激素化(PNA)大鼠,具体造模方法参照参考文献[11]。将上述购入的大鼠雌、雄分笼饲养于华中科技大学同济医学院动物实验中心SPF 级屏障系统[设施证明号:SYXK(鄂)2016-0057]。实验期间,大鼠自由饮食,温度、光照和湿度均符合SPF 级动物房要求。整个实验过程中动物的处理遵循华中科技大学动物研究委员会指南(伦理号:2298)。适应性喂养1周后,每日下午3时对雌性SD 大鼠行阴道涂片,在显微镜下观察,若处于动情前期则与雄性SD 大鼠合笼。次日在显微镜下观察阴道涂片,若有精子,则记为怀孕第1日。在大鼠怀孕第16日至第19日给予皮下注射0.3mL含3mgDHT 的小麻油或0.9%氯化钠溶液。将注射DHT 的孕鼠诞下的雌性子鼠按照随机数字表法分配为模型组(M 组)、电针组(EA 组)、假电针组(SA 组),注射0.9%氯化钠溶液的孕鼠诞下的雌性子鼠则为正常组(N 组),每组8只。

2.2 干预方法 于雌性子鼠出生后第36 日开始干预。EA 组选取双侧足三里、双侧三阴交和气海。腧穴定位标准参照参考文献[12]。将子鼠固定于自制布袋中,露出后肢和腹部,将一次性无菌针灸针快速刺入相应穴位并捻转,并在同侧足三里、三阴交连接电针仪,通上强度为2 Hz、脉冲长度为0.3 ms、频率为2mA的电流,使其肌肉轻微颤动。每日1 次,每次25min,连续治疗5d后休息2d,重复该治疗过程至其出生后第49日。SA 组选取4个非经非穴点施针,其中两个为子鼠双侧足三里与阳陵泉连线的中点,另外两个为关元旁开3寸。将子鼠固定于自制的布袋中并露出后肢和腹部,将针快速刺破皮肤后不捻转,针刺深度＜5mm。将针接上电针仪但不接通电流,干预时间与电针组一致。同期M 组和N组亦被固定在自制布袋中,但不给予针刺处理,固定时间与其他两组相同。

2.3 阴道涂片和动情周期观察 分别于雌性子鼠出生后第29日至第49日早上8点行阴道涂片,并置于显微镜下观察。根据细胞种类的不同或占比多少判定大鼠的动情周期[13]。大鼠动情周期包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期,各阶段特点如图1所示。具体而言,动情前期以有核上皮细胞为主,偶尔伴有少量白细胞;动情期以无核角化细胞为主,白细胞和上皮细胞很少或显微镜下不可见;动情后期则白细胞、上皮细胞、角化细胞均能在显微镜下观察到;动情间期以白细胞为主,显微镜下可见大量白细胞,或大量白细胞和上皮细胞。多囊卵巢综合征大鼠常伴有紊乱的动情周期,并可见延长的动情间期。

图1 大鼠动情周期各个阶段阴道涂片显微镜下细胞形态特点(10X)

2.4 样本采集 于雌性子鼠出生后第49 日采集样本。用1%的戊巴比妥进行腹腔注射,子鼠深度麻醉后经腹主动脉采集血样,离心30 min分离血清,存于-80 ℃冰箱待测。采集血样后对子鼠实施处死,迅速收集子鼠下丘脑和卵巢组织,用锡箔纸包装后放入-80 ℃冰箱。

2.5 卵巢组织形态学观察 卵巢用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,纵向连续切成4μm 厚的切片。切片用苏木精和伊红染色,光镜下观察卵巢的组织形态学。

2.6 蛋白免疫印迹法 将下丘脑和卵巢组织溶解于含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液中,随后以4℃的离心机(离心速度12000r/min)离心15min取上清液,上清液即为总蛋白。用BCA 蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度,根据蛋白浓度,按40 mg上样量计算上样体积。提取的蛋白样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上(孔径0.22mm)。转膜后的条带用5%脱脂牛奶在封闭室温下封闭60 min。随后放入一抗孵育盒,4 ℃条件下过夜,一抗稀释比例如下:β-actin,稀释比为1∶5000;AR,稀释比为1∶100;PR,稀释比为1∶1000;ER,稀释比为1∶100。第2 日,将条带用TBST 缓冲液连续洗3次,每次10min,随后用二抗孵育盒(稀释比为1∶10000)在室温下避光孵育90min,之后条带用TBST 缓冲液避光连续洗3 次,每次10min。最后,在双色红外荧光成像系统odyssey(LICOR,美国)下扫膜,查看条带。

2.7 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件分析数据。计量资料采用K-S检验,若符合正态分布且方差齐,以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 动情周期 N 组为正常的动情周期,包括动情间期、动情前期、动情期和动情后期。M 组动情周期无动态变化,动情期和动情前期明显缩短,呈持续动情间期。EA 组与SA 组动情间期明显缩短,动情期和动情前期延长。见表1。

表1 4组大鼠动情周期各阶段时长(d)

3.2 卵巢组织形态学观察 N 组在各个阶段的卵泡和黄体均可见,卵泡内结构清晰,颗粒层较多,排列整齐;M 组可见多个囊性卵泡,卵泡的颗粒细胞层明显减少,排列紊乱,且黄体少见;EA 组黄体和窦性卵泡较M组增多,囊性卵泡少见;SA组仍可见囊性卵泡。见图2。

图2 4组大鼠卵巢组织形态学变化

3.3 下丘脑中AR、ER 及PR 蛋白表达比较 4组大鼠下丘脑中AR、PR 蛋白表达总体比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。M 组下丘脑中AR 蛋白表达高于N组,ER 蛋白表达低于N 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。EA 组下丘脑中AR 蛋白表达低于M 组,ER 蛋白表达高于M 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。SA组下丘脑中AR、ER蛋白表达与M 组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。4组大鼠下丘脑中PR蛋白表达总体比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3、表2。

表2 4组大鼠下丘脑中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白条带灰度值与内参值的比值比较(±s)

表2 4组大鼠下丘脑中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白条带灰度值与内参值的比值比较(±s)

注:1.N 组,正常组;M 组,模型组;EA 组,电针 组;SA 组,假 电针组;AR,雄激素受体;PR,孕激素受体;ER,雌激素受体。2.与N 组比较,△P＜0.05;与M 组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 AR/β-actin ER/β-actin PR/β-actin N 组 8 1.12±0.15 1.27±0.15 4.21±0.58 M 组 8 1.70±0.25△ 0.69±0.20△ 4.00±0.34 EA 组 8 1.16±0.19▲ 1.06±0.18▲ 4.08±0.58 SA 组 8 1.71±0.18 0.70±0.09 3.87±0.31

图3 4组大鼠下丘脑中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白表达水平

3.4 卵巢中AR、ER 及PR 蛋白表达比较 4组大鼠下丘脑和卵巢中AR、ER 蛋白表达总体比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。M 组卵巢中AR 蛋白表达高于N 组,ER 蛋白表达低于N 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。EA 组卵巢中AR 蛋白表达低于M 组,ER 蛋白表达高于 M 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。SA 组卵巢中AR、ER 蛋白表达与M 组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。4组大鼠卵巢中PR 蛋白表达总体比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见图4、表3。

表3 4组大鼠卵巢中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白条带灰度值与内参值的比值比较(±s)

表3 4组大鼠卵巢中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白条带灰度值与内参值的比值比较(±s)

注:1.N 组,正常组;M 组,模型组;EA 组,电 针组;SA 组,假电针 组;AR,雄激素受体;PR,孕激素受体;ER,雌激素受体。2.与N 组比较,△P＜0.05;与M 组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 AR/β-actin ER/β-actin PR/β-actin N 组 8 1.28±0.20 2.15±0.13 0.91±0.10 M 组 8 1.89±0.15△ 1.52±0.19△ 0.78±0.17 EA 组 8 1.36±0.13▲ 2.09±0.19▲ 0.79±0.12 SA 组 8 1.66±0.20 1.56±0.18 0.90±0.05

图4 4组大鼠卵巢中雄激素受体、孕激素受体、雌激素受体蛋白表达水平

4 讨论

PCOS是一种常见的内分泌疾病,其特点是慢性无排卵和高雄激素血症,临床主要表现为月经周期不规律、多毛、痤疮和不孕等。目前,西医对本病的病因与发病机制尚未完全明确。PCOS归属中医“不孕症”“月经后期”“闭经”等范畴。《素问·上古天真论》云:“女子七岁,肾气盛,齿更发长;二七而天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下,故有子。”冲脉不盛,任脉不通,气血无法顺利下行,导致月经延期、稀发;痰瘀阻滞冲任、胞宫,则卵泡成熟障碍;痰瘀阻滞胞宫,积而不去,形成癥瘕,导致卵泡排出障碍。朱虹丽等[14]通过查阅文献探析PCOS的证型分布,结果显示PCOS以肾虚为本,痰湿瘀阻为标,虚、痰、瘀贯穿本病的全过程,并影响着病情的发展。肾藏精,主生殖,肾气的盛衰在天癸的产生中起主导作用。夏桂成[15]认为本病所处阶段始终停留在经后期,其主要病理归咎于肾阴癸水不足,卵子不能发育成熟,痰湿蕴阻,卵巢呈多囊样改变。阴阳互根,阴虚日久及阳,肾阳虚衰,火不暖土,致脾阳不振,不能运化水液,水湿内停,湿聚成痰,痰湿壅盛,膏脂充溢于形体,表现为形体肥胖;同时痰湿阻碍机体气血运行而成瘀,气血不能下注于胞宫,表现为月经量少、月经后期、闭经甚至不孕;湿为阴邪,易伤阳气,久则损及脾肾,故痰湿进一步导致肾虚加重,形成恶性循环。

针灸疗法具有多靶点、多层次、整体调节的作用特点,在临床上被广泛用于治疗各类不孕症[8,16]。中医认为,PCOS的基本病机是阴阳失衡、气血失调及脏腑经络功能障碍[17]。本研究主要观察电针对青春期PCOS大鼠下丘脑和卵巢组织中性激素受体表达的影响,首先通过注射DHT 成功建立青春期PCOS大鼠模型,再选取足三里、三阴交和气海进行电针操作。根据经络腧穴理论,气海为任脉穴,是一身之元气聚集之处,可以调节全身气机。三阴交是足三阴经交汇处,可以补益肝肾、健脾利湿,恢复气血运行。足三里是足阳明胃经合穴、胃之下合穴,具有健运脾胃、补益后天之本和益气养血之功。加用电针刺激以上三穴能进一步强化其调补肝脾肾、补益先后天之本、补益气血、调节阴阳失衡、促进气血运行的作用。研究结果显示,经电针治疗后,青春期PCOS大鼠动情周期紊乱及卵巢多囊形态均明显改善,假电针虽能在一定程度上改善青春期PCOS大鼠动情周期,但对卵巢多囊形态无明显影响,表明电针在改善青春期PCOS大鼠卵巢多囊形态方面明显优于假电针。

PCOS的神经内分泌特征是GnRH 和LH 的脉冲频率和幅度升高。PNA 动物在青春期就表现出PCOS的神经内分泌特征,如GnRH 和LH 释放频率和水平明显增加、高雄激素血症等,是研究青春期PCOS下丘脑神经内分泌异常的理想模型[18]。因此,笔者采用PNA 大鼠作为青春期PCOS 模型。PCOS模型大鼠表现出不规则的动情周期和卵巢形态改变,包括动情间期持续时间延长、动情期减少、囊性卵泡增加、窦状卵泡减少、排卵前卵泡及黄体数量减少等,表明模型大鼠卵泡发育障碍并排卵减少。此外,PCOS模型大鼠还表现出PCOS的神经内分泌特征,即血浆LH 水平的升高,下丘脑GnRH 的释放增加[10]。在下丘脑弓状核,Kisspeptin神经元是性激素的负反馈作用靶点,性激素通过与Kisspeptin神经元上的相应受体结合,反馈性抑制Kisspeptin 表达,进而抑制Kisspeptin-GPR54信号通路,降低GnRH 和LH 的分泌[19]。下丘脑中性激素受体表达异常可通过Kisspeptin-GPR54信号途径导致GnRH 和LH 的异常分泌。TIANL等[20]对258例PCOS患者的AR 基因编码外显子进行测序分析,检测到5个杂合子突变,即p.V3M、p.Q72R、p.S158L、p.S176R 和p.G396R,表明AR 的突变或异常表达与PCOS 的发生密切相关。出生前雄激素化的成年雌性大鼠中AR 的过度激活可导致GnRH 脉冲发生器过度活跃[21]。DOUMA Z 等[22]发 现PCOS 患 者ER 基 因 变 异(rs2234693、rs3798577、rs3020314和rs1256049)与LH、LH/FSH或雄激素水平升高相关,与代谢综合征(rs9340799)和高血糖(rs3798577)相关性更为显著。雌激素受体α亚型(ERα)敲除的雌性小鼠表现出血浆LH 水平显著升高和GnRH mRNA表达增加[23]。以上研究表明,ER、AR的异常表达可导致PCOS的神经内分泌紊乱。

本研究结果显示,PCOS 模型大鼠下丘脑中AR蛋白表达增加,ER 蛋白表达下降,而PR 则无变化,这为AR、ER 参与PCOS 异常的神经内分泌提供了证据。本课题组前期研究发现,电针可通过调节下丘脑Kisspeptin/GnRH 系统而改善青春期PCOS 大鼠的神经内分泌异常[10]。本研究结果显示,EA 组下丘脑中AR 蛋白表达下调,ER 蛋白表达上升,进一步证明电针对青春期PCOS大鼠动情周期紊乱情况和卵巢多囊形态的改善作用可能与其调节下丘脑和卵巢中的AR 和ER 表达有关。电针通过纠正下丘脑中异常表达的AR 和ER,恢复性激素对Kisspeptin/GnRH/LH系统的负反馈调节作用,从而改善青春期PCOS的神经内分泌异常。ER 是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育及排卵功能的关键受体[24]。本研究结果显示,干预前青春期PCOS模型大鼠卵巢中ER 蛋白表达下降,表明卵巢中ER 蛋白表达下降与PCOS卵泡发育不良和排卵障碍有关[25]。此外,AR在卵泡发育调节中亦发挥重要作用。有研究显示,敲除AR 的大鼠生殖能力明显下降,表现为卵泡发育不良、排卵减少及卵巢早衰[26-27]。然而,PCOS的卵巢局部雄激素水平过高或AR 表达异常增加虽然可以刺激更多始基卵泡进入生长周期,但却可抑制卵泡的发育成熟及排卵,从而导致卵巢多囊样改变[28]。本研究结果显示,干预前青春期PCOS模型大鼠卵巢中AR 蛋白表达明显增加;给予电针治疗后,青春期PCOS模型大鼠卵巢中ER、AR 蛋白的异常表达均得到改善,表明电针治疗可抑制AR、ER 在卵巢中的异常表达。

综上所述,青春期PCOS模型大鼠的卵泡发育和排卵功能障碍与下丘脑和卵巢中ER、AR 的异常表达有关。电针可改善青春期PCOS 模型大鼠的排卵障碍,其作用机制可能与上调下丘脑和卵巢中ER 的表达,以及下调AR 的表达有关。本实验结果部分阐释了低频电针治疗PCOS 的作用机制,为电针改善PCOS提供了一定的实验证据支持。然而本研究观察指标较少,仅仅在蛋白水平探讨了电针对下丘脑和卵巢性激素受体变化的影响,还需进一步的探究其基因表达,特别是下丘脑具体神经元核团和卵巢具体细胞中的表达变化。