自制高浓度样本对全自动血细胞分析仪的线性验证及评价

刘佳惠 王贝 杨楠 周丽玲

全血细胞计数是血液学检验最基础和常用的一类检验项目，在血站日常工作中用于成分献血者的初筛和全血及成分血质量指标的检测，其检测结果的有效性至关重要。MEK-7300P血细胞分析仪是本单位新购进的一款日本光电公司的全自动五分类血细胞分析仪。按照CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》的要求：医学实验室在仪器设备安装使用前应验证其能达到的必要性能，并能符合相关检验检测要求[1-4]。为了保证该仪器提供的检验结果准确可靠，本实验室参照中华人民共和国卫生行业标准WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目的分析质量要求》和WS/T 408-2012《临床化学设备线性评价指南》的方法对MEK‐7300P血细胞分析仪红细胞（red blood cell，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、红细胞压积（hematocrit，HCT）、白细胞（leukocyte，WBC）和血小板（platelet，PLT）检测项目的线性范围进行验证和评价[5-9]。目前，市场上的线性质控物较少且血站日常工作中很难遇到高值样品，影响了行业标准在日常工作中的应用[10]。现介绍一种自制高浓度血液样本的方法可快速完成血液分析仪线性验证，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

样本均来源于2023年3月徐州市红十字血液中心健康献血者。采集新鲜全血标本2 mL，置于乙二胺四乙酸二钾（ethylenediamine tetra acetic acid dipotassium salt dipotassium salt，EDTA-K2）真空抗凝管内，充分混匀后在4 h内检测完毕。

1.2 仪器与试剂

MEK-7300P全自动血细胞分析仪及其原装配套试剂、质控品和校准品（日本光电公司），且均在有效期内。AXTDL5M台式低温冷冻离心机（安信实验仪器有限公司）、微量移液器及一次性耗材。

1.3 方法

实验由献血服务科熟悉系统操作的中高级职称人员操作，实验前对仪器进行维护和校准，确保仪器处于正常状态。

1.3.1 高浓度血细胞样品的制备

选取当天4份同血型的献血者全血标本，混合后用离心机800 r/min离心5 min，用微量移液器吸取大部分血浆至新EDTA-K2真空抗凝管A中后，获得约3 mL高浓度RBC、Hb和HCT样品。再选取当天全血标本（ABO血型可不同）20份和新试管A中的富血小板血浆混合后倒入6支5 mL离心管中。（1）离心3 000 r/min离心10 min，用蓝色枪头尽量吸取含丰富WBC和PLT的白膜层（可混入一定量的血浆和红细胞）混合备用（约5 mL分装至2支EDTA-K2抗凝真空采血管内）。（2）摇匀后放入离心机中，再次3 000 r/min离心5 min，用蓝色枪头尽量吸取含丰富WBC和PLT的白膜层，得到约4 mL高浓度WBC和 PLT样品。

1.3.2 线性验证样本的制备与测定

用MEK-7300P血细胞分析仪配套稀释液将自制高浓度血液样本按100%、80%、60%、40%、20%和0的比例进行稀释。充分混匀后，每个浓度重复测定3次，测定顺序随机，并取其理论值为预期值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理及分析。验证方法一，按照WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目的分析质量要求》的方法，每个项目得到6组预期值及实测平均值，建立比对实测值与预期值的直线回归方程Y=bX+a，求得相关系数（r），若线性回归方程的斜率在（1.00±0.05）范围内，相关系数r≥0.975，或r2≥0.95，则认为该项目在此仪器线性范围验证中通过[8]。验证方法二，按照WS/T 408-2012《临床化学设备线性评价指南》的方法，剔除离群值，进行多项回归分析，确定最优拟合方程[9]。若数据拟合结果为统计学标准的线性，则继续对数据组进行精密度检验；若数据拟合结果为统计学标准的非线性，则计算最优拟合曲线与直线的平均差异值（average deviation from linearity，ADL），判断是否为临床可接受的非线性，并计算数据的不精密度。

2 结果

2.1 高浓度血细胞样品的制备

测定高浓度血液样本RBC、Hb和HCT原始结果为9.30 g/L、284 g/L和85.7%。高浓度WBC和 PLT样品中WBC浓度为69.6×109/L时，血小板显示OVER（超出可测定范围），经血细胞分析仪配套稀释液稀释后为1 444×109/L。各项目的正常值范围、厂家声明线性范围与实际验证线性范围见表1，达预期要求。

表1 各项目的正常值范围、厂家声明线性范围与实际验证线性范围

2.2 验证方法一

根据样品配制的浓度稀释关系，各项目的6组预期值及实测平均值见表2。 建立实测值与预期值的直线回归方程Y=bX+a，相关系数r和r2见表3。各项目的线性回归方程斜率b均在（1.00±0.05）内，且均满足相关系数r≥0.975和r2≥0.95。

表2 各项不同浓度样本的实测平均值和预测值

表3 各项目实测值与预期值的直线回归方程Y=bX+a，相关系数r和r2

2.3 验证方法二

2.3.1 多项回归分析

采用格拉布斯（Grubbs）法剔除离群值后进行多项回归分析，得出一阶多项式（Y=b0+b1X）、二阶多项式（Y=b0+b1X+b2X2）和三阶多项式（Y=b0+b1X+b2X2+b3X3）各项目线性验证的多项回归结果见表4～表8。对非线性系数b2和b3进行t检验，表明各项目的二阶和三阶系数差异均无统计学意义（P＞0.05），各项数据均符合统计学标准的线性，各项目最优拟合方程见图1。

图1 RBC、Hb、HCT、WBC 和PLT的最优拟合方程

表4 RBC拟合方程参数及最优拟合方程

表5 Hb拟合方程参数及最优拟合方程

表6 HCT拟合方程参数及最优拟合方程

表7 WBC拟合方程参数及最优拟合方程

表8 PLT拟合方程参数及最优拟合方程

2.3.2 数据的精密度检验

RBC、Hb、HCT、WBC和PLT的不精密度值分别为3.10%、3.50%、2.94%、2.55%和1.86%，均小于判定界值8.45%，表明数据的精密度良好，可满足线性验证多项回归分析的统计学要求。

2.4 线性判断

各项目的正常值范围、厂家声明线性范围与实际验证线性范围见表1。RBC、HGB、HCT、WBC和PLT项目的线性验证结果均符合WS/T 406-2012和WS/T 408-2012的要求，其线性范围验证通过。虽然试验未完全获得厂家声明的线性范围浓度的样本，但是通过对历史数据的回顾与统计，MEK-7300P 全自动血细胞分析仪的实际线性验证范围已涵盖血站日常检测工作中99.9%以上的标本范围，故此次验证线性范围可满足血站日常检测的工作需要[11-13]。

3 讨论

根据《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）对献血者初筛化验，血细胞分析仪的准确性直接影响了对献血者是否能够献血和献血量多少的判定[14]。根据《全血及成分血质量要求》（GB 18469-2012）需对血液制品中PLT、Hb、WBC、HCT等项目进行质量控制要求的检测[15]。其中血细胞含量是高值的质量控制项目有浓缩红细胞的血细胞压积、浓缩血小板和单采血小板中血小板的含量、单采粒细胞中粒细胞含量等；血细胞含量是低值的质量控制项目，有去白细胞产品的残留白细胞量、血小板产品中的红细胞混入量等[16-18]。并且，超出一定的范围，检验方法的准确度就会受到影响[19]。在血站的检验工作中，需要检测不同项目的高中低值，所以验证线性范围的工作是十分必要的[16]。

由于符合厂家提供的仪器线性范围的高浓度样品常常难以获得，利用日常标本自制高浓度血细胞对血液分析仪做线性验证和评价，既经济快捷，又满足了质量评价的要求，对血细胞分析仪的线性范围验证具有一定的参考意义[20-21]。本研究的创新点在于：（1）制备高浓度血液样本方法简单高效，一次富集可获得多个高值样本，满足绝大部分血站工作的日常检测需求。（2）比较两种线性范围验证方法，更加全面而严谨，并为以后工作中选择线性验证的方法打下基础。本研究采用仪器配套稀释液对高浓度样品进行稀释，是否会因与血液标本的基质不同产生基质效应而导致对样本的检测结果产生影响，有待进一步探究。

综上所述，自制高浓度血液样本较好满足MEK-7300P全自动血细胞分析仪的线性验证要求。比较两种验证方法，线性范围宽，与仪器说明书提供的产品性能基本一致，均满足了线性范围评价的要求，适合做血站日常工作的可报告范围使用。其中，方法一，将实测值和预测值的相关性进行定性分析，方便高效。方法二，将实测值与最优拟合值进行多项式分析，对其非线性程度进行判断和数据的精密度分析，可判断出线性范围内数据的变化趋势和数据精密度导致统计功效的高低。方法二线性验证的统计分析方法更加科学而全面，还可用于新项目测定线性范围的摸索和建立。本研究建立的线性验证方案简便实用，可根据不同需求建立标准化、规范化的血细胞分析仪性能验证程序，为线性范围的验证提供了新思路，供大家参考。