蒜和葱上二斑叶螨的发生为害及其抗药性监测

田甜　张妍　张友军等

关键词 二斑叶螨；百合科蔬菜；抗性监测；靶标基因；突变频率

中图分类号：S 436.33 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022447

二斑叶螨Tetranychus urticae Koch属真螨目叶螨科，是世界范围内普遍发生的重要农业害螨，其取食寄主植物汁液后，在取食处首先造成极小的褪绿斑点，严重时导致叶片发黄，甚至干枯脱落[1]，严重影响农作物的产量和品质。二斑叶螨防控主要依赖于化学药剂，其生活史短、世代重叠、可孤雌生殖、繁殖力强等生物学特性导致其对化学药剂的抗性发展迅速[2]。在全球对农作物造成重大经济损失的抗性害虫／害螨中，二斑叶螨排名第五位[3]，在欧洲、澳大利亚、土耳其、加拿大、中国均有二斑叶螨抗药性的报道[4-9]，这给该螨的综合治理带来极大挑战。

二斑叶螨寄主植物极其广泛，可为害包括茄科、豆科、葫芦科、伞形科等在内的至少1100种不同作物[10]，由于其个体微小且迁移能力弱等特性，致使其对寄主植物的选择性较弱而适应性较强[11-12]。前期研究表明，寄主植物的次生代谢产物可能会影响取食植物的害虫／害螨体内的解毒酶含量、活性等指标[13-14]，也直接影响害虫／害螨对寄主植物的取食适合性和嗜好性，如长期饲养在夹竹桃上的二斑叶螨，可在番茄上取食，但长期取食番茄的二斑叶螨，却不能在夹竹桃上存活[15]。蒜和葱为百合科蔬菜作物，據报道也属于二斑叶螨的寄主植物，但与苹果、花生、女贞、大叶黄杨、马铃薯等植物叶片相比，二斑叶螨对蒜叶片的选择率很低[16]；田间不同比例地间作蒜对于二斑叶螨及其同属的截形叶螨T.truncatus种群具有明显抑制作用[17-19]。且在实际生产中，二斑叶螨在葱、蒜等百合科蔬菜上发生为害的情况也极为罕见且鲜有报道，说明二斑叶螨虽然可以为害蒜，但蒜并非其很常见的嗜好寄主植物。

2022年春季笔者在北京海淀区蔬菜温室内调研发现，二斑叶螨在百合科蔬菜蒜和葱上呈现严重的为害症状。为探明二斑叶螨在这两种百合科蔬菜上的抗药性状况，本研究首先调查了二斑叶螨在蒜和葱上的种群数量，监测了这2个种群对不同药剂的抗性，并对其常用化学药剂的抗性相关基因突变频率进行研究，以期为指导二斑叶螨在百合科蔬菜上的化学防控提供科学基础。

1材料与方法

1.1二斑叶螨种群

二斑叶螨实验室种群来源于中国农业科学院植物保护研究所捕食螨研究课题组，于室内菜豆无虫苗上饲养超过10年，期间未使用任何农药，饲养条件为：温度（26±1）℃，相对湿度（60±5）%，光周期L∥D=16 h∥8h。二斑叶螨田间种群于2022年4月采集于北京海淀区中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜试验温室，采集的雌成螨直接用于本试验。

1.2试验药剂

所用药剂均为商品制剂，其含量、剂型及来源如下。1.8%阿维菌素乳油（EC），河北威远生化农药有限公司；43%联苯肼酯悬浮剂（SC），麦德尔美（上海）化工有限公司；240 glL虫螨腈悬浮剂（SC），巴斯夫（中国）有限公司；30%腈吡螨酯悬浮剂（SC），日产化学工业有限公司；15%哒螨灵乳油（EC），浙江永农生物科学有限公司。

1.3二斑叶螨种群数量调查

所调查温室面积大约330m，温室内葱Alliumfistulosum L.和蒜A.sativum L.混合栽种，种植时间为2021年10月底，调查时间为2022年4月上旬，当时二者均处于生长中后期，周边种植有韭菜、油菜等其他蔬菜。对2种寄主植物进行随机抽样调查其植株上二斑叶螨数量，分别调查记录1次。每个寄主调查10株，重复4次，共计调查40株。记录每株上二斑叶螨的成螨数量。

1.4二斑叶螨抗药性测定

采用浸叶法对上述2个二斑叶螨田间种群进行抗药性监测[20]。将0.1%的琼脂加入到直径3.5 cm的塑料皿底部，冷却凝固后待用。用蒸馏水将每种测试药剂稀释成5～7个浓度。将新鲜干净的菜豆叶片修剪为直径2.0 cm的小叶碟，将叶碟浸入待测药液中10 s后取出，室温晾干后，将叶碟的叶背向上平整铺在凝固的琼脂上，按浓度从低到高的顺序重复上述操作，每处理不少于4次重复。用零号毛笔挑取活跃的、状态一致的雌成螨25～30头于每个叶碟上，然后盖上有10个极细微小孔的培养皿上盖（采用加热后的昆虫针制作），再转移至温度（26±1）℃、相对湿度（60±5）%、光照周期L∥D=16 h∥8h的人工气候箱中饲养和观察。24 h后在体视显微镜（SZX-7，奥林巴斯）下检查记录测试叶螨的死亡数及存活数，用毛笔尖轻轻触碰螨体，仅有1只足活动或者完全不动者判为死亡[20]。

1.5二斑叶螨DNA提取及抗性基因突变检测

利用基因组DNA提取试剂盒（KAPA）提取单头二斑叶螨的基因组DNA，具体操作过程按照试剂盒说明书进行。在1.5mL离心管中加入30μL提取液（0.5μL1 U／μL的提取酶，3.0μL 1U/μL缓冲液和26.5μL ddHO），用昆虫针小心挑取一头雌成螨放入离心管中，使用塑料研磨杵进行充分研磨后将其放入PCR仪中进行反应，程序设置为：75℃10 min，95℃5 min。提取后的DNA样本于-20℃冰箱中保存备用。

对上述2个种群的二斑叶螨单头DNA分别进行PCR扩增，检测阿维菌素抗性基因谷氨酸氯离子通道（glutamate-gated chloride channel，GluCl）的G314D和G324E位点、哒螨灵抗性相关的线粒体电子传递复合物Ⅰ的PSST亚基上突变位点H92R位点和联苯肼酯抗药性相关基因细胞色素b（cyto-chrome b，Cytb）突变位点G126S的突变频率。每个种群每个位点至少检测30个样本。突变位点的频率检测所用特异性引物参考已发表文献[21]，详见表1。PCR扩增体系：DNA 2.0μL，上、下游引物各1.25μL（10mmol／L），dNTPs 0.5μL，5×Q5反应缓冲液5μL，5×Q5 High GC Enhancer 5μL，Q5高保真聚合酶0.25μL，ddHO 9.75μL。PCR扩增在S1000热循环仪（Bio-Rad，CA，USA）中进行，反应程序如下：98℃变性30s；98℃10s，56.5～59.0℃20 s，72℃ 20 s，35个循环；72℃延伸2 min。获得PCR产物纯化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司使用特异性引物进行双向测序。

1.6数据分析

采用Polo Plus 2.0软件对二斑叶螨抗性测定数据进行分析，得到斜率±标准误、致死中浓度LC、95%置信区间、卡方值及自由度。敏感种群的LC来自本实验室最近发表的数据[9]。抗性倍数一田间种群的LC值／室内敏感种群的LC值。抗性水平的评價参照以往文献中描述的分级标准[9]：敏感（RF≤3）、低水平抗性（31000）。抗性等位基因的频率按以下公式计算：点突变的基因突变频率=[抗性纯合子个体数／检测总数十抗性杂合子个体数／（检测总数×2）]×100%。

2结果与分析

2.1蒜和葱上二斑叶螨种群数量

混栽的2种百合科蔬菜蒜和葱受二斑叶螨为害症状明显（图1b和图1c），调查时蒜叶片数量为7.40片／株，葱叶管数量平均为8.40片／株，对2种寄主植物上二斑叶螨发生数量调查发现，蒜上种群数量为99.35头／株，葱上为253.00头／株，葱上二斑叶螨单株平均数量是蒜单株数量的2.55倍，差异显著（图1a）。

2.2二斑叶螨2个种群对化学药剂的抗性

监测了蒜和葱上2个二斑叶螨种群对不同药剂的抗性，结果见表2。蒜二斑叶螨和葱二斑叶螨种群对所测试药剂的抗性存在不同程度的差异。二斑叶螨蒜种群和葱种群对阿维菌素均呈现极高水平抗性（抗性倍数RF分别为10686.3倍和10259.6倍）；对联苯肼酯抗性分别为72.3倍和35.7倍，均呈现中等水平抗性；对腈吡螨酯分别呈现高水平抗性（RF=207.1倍）和中等水平抗性（RF=52.2倍）；对虫螨腈均为高水平抗性（RF分别为170.0倍和185.8倍）。2个种群对哒螨灵的抗性测定中，哒螨灵浓度高达5000 mg/L时，测试种群死亡率仍低于50%，说明对哒螨灵抗性倍数至少为中等抗性水平以上。

从致死中浓度LC来看，阿维菌素、联苯肼酯和腈吡螨酯这3种药剂对二斑叶螨蒜种群的LC值均高于葱种群，其中阿维菌素和联苯肼酯对2个种群的毒力活性差异不显著，而腈吡螨酯对2个种群的毒力活性差异显著。哒螨灵对测试二斑叶螨种群的毒力活性极低（表2）。

2.3二斑叶螨2个种群的抗性基因突变检测

针对使用历史较长的2种药剂阿维菌素、哒螨灵和新型药剂联苯肼酯，检测其抗性相关基因的突变频率。2个二斑叶螨田间种群中与阿维菌素抗性相关的GluCl1上的G314D位点和GluC13上的G326E位点的突变频率均为100%，与哒螨灵抗药性相关的PSST亚基上的突变位点H92R在2个测试种群中的突变频率也均为100%，表明这2个种群中上述靶标基因均为纯合抗性。对于可能参与联苯肼酯抗药性相关基因Cytb上的G126S位点来说，二斑叶螨蒜种群上该位点突变频率为9.09%，葱种群则为24.14%，主要以杂合子形式存在（表3）。

3结论与讨论

二斑叶螨寄主范围极广，百合科作物虽然也列为其寄主，但田间发生为害的报道极少，仅在珠芽百合Lilium bulbierum和筋骨草Tulipa turkestani-ca上有过相关报道[22]，而取食蒜和葱等百合科蔬菜作物并造成严重为害的情况在以往未见报道。之前研究发现，二斑叶螨对众多寄主植物及品种也存在明显的选择性[23]，本次调查中发现的蒜、葱受到二斑叶螨严重为害，单株叶螨数量可高达99.35～253.00头，这在实际生产中并不常见，推测蒜和葱不同品种可能与二斑叶螨的发生相关，这值得进一步关注；同时也需要指出，本文并未采用蒜和葱单位叶面积上的叶螨种群数量来进行更精准的对比，且本研究调查时葱的叶管数量也略多于蒜叶片数量，但这并非是导致葱上二斑叶螨种群数量高于蒜上种群数量的主要原因，而寄主植物种类／品种对于叶螨取食的适合性可能是造成这种差异的最关键因子。二斑叶螨作为全球范围内为害严重的多食性害虫，其快速适应寄主的能力且伴随的低适合度代价引起了广泛关注[24]，对其取食选择机制尚不清楚，还需要更多研究。

本研究中，来自北京海淀区温室内种植的蒜和葱上的二斑叶螨种群对阿维菌素呈现极高水平的抗性，抗性倍数超过10000倍，这与以往研究中二斑叶螨的高抗性监测结果是一致的[9，20-21]。阿维菌素是一种广谱性杀虫杀螨剂，在我国使用广泛，查阅中国农药信息网，阿维菌素已登记1499条，远高于其他杀螨剂，如哒螨灵（328条）、虫螨腈（202条）、腈吡螨酯（2条）、联苯肼酯（59条）等。其中，阿维菌素防控二斑叶螨效果下降的案例常见[25]，田间长期的选择压导致二斑叶螨对阿维菌素的抗药性持续稳定，这也可能与较高的抗性靶标基因突变频率有关。二斑叶螨GluCl1上的G314D位点和GluCl3上的G326E被报道与阿维菌素抗性有关[26-27]，本研究中发现，二斑叶螨蒜和葱2个种群中与阿维菌素抗药性相关的G314D和G326E位点的突变频率均达到100%，为纯合抗性种群，说明靶标抗性可能是该种群对阿维菌素的主要抗性机制，化学防控更加困难。我们也注意到，测试的2个种群中抗性突变频率高于北京同一区域内油菜、辣椒等其他蔬菜作物上的二斑叶螨的突变频率[9]，这也从一个侧面解释了二斑叶螨种群对阿维菌素抗性居高不下的原因。以往研究表明，截形叶螨对阿维菌素敏感度高[28]，而阿维菌素对截形叶螨的田间防效也表现优[29]，但该药剂对二斑叶螨完全无效，因此，加强叶螨防控中依据其种类进行针对性科学选药的宣传普及极为重要。

本研究所测试的2个二斑叶螨种群对传统杀螨剂哒螨灵的LC值大于5000 mg/L，这与近期刚报道的我国其他地区二斑叶螨种群对哒螨灵的抗性结果相似[21]；同时，哒螨灵抗药性相关位点H92R突变频率在本研究及以往检测中均达到100%，亦为纯合抗性种群，综合本研究结果以及近年来对于我国各地区的二斑叶螨抗药性监测结果，哒螨灵单剂在田间使用时对二斑叶螨的防效也将远低于预期效果，需要谨慎选用。然而，该药剂与其他药剂的复配剂是否可以起到协同增效作用尚不清楚，需要进一步研究，以期延长杀螨剂的使用寿命。

本研究中所测试的蒜和葱2个二斑叶螨种群对除腈吡螨酯外的4种测试药剂的敏感性差异不大，这可能与同一种植区域内统一施药管理及叶螨在2种寄主植物间存在不同程度的迁移有关。蒜和葱上二斑叶螨对联苯肼酯、虫螨腈和腈吡螨酯这3种新型药剂的抗药性为中等到高水平抗性，明显比前期本实验室测定的海淀二斑叶螨油菜种群抗性程度高（北京海淀种群2020年对这3种药剂均呈低抗性水平）[9]，说明二斑叶螨对新型杀螨剂的抗性还在进一步发展，其化学防控中亟须关注轮换施药及采用增效药剂组合进行防控。同时，在本研究的测试结果中，同一区域内，百合科作物蒜和葱2个二斑叶螨种群对腈吡螨酯的药剂敏感度差异显著，是否存在因寄主植物不同而影响了二斑叶螨的药剂敏感度尚不确定，其内在机制值得关注。

之前研究报道二斑叶螨Cytb基因上的G12 6S位点突变与其对联苯肼酯产生抗药性有关[10，30-31]，本研究中二斑叶螨蒜种群中G126S位点突变频率为9.09%，明显低于二斑叶螨葱种群的突变频率24.14%，而蒜种群对联苯肼酯的抗性水平却高于葱种群对联苯肼酯的抗性，这与以往研究结果类似[9]，单独G126S突变不会影响二斑叶螨对联苯肼酯的抗药性，与I126T或S141F共同作用时才可能会影响其对联苯肼酯的抗药性[32]，而本研究的2个种群中并未发现其他突变位点。基于以往研究，二斑叶螨对联苯肼酯也进化出了较为复杂的抗性机制，因此田间选用联苯肼酯防治二斑叶螨时，也需要更加科学地轮换施药。近期研究结果表明，田间二斑叶螨对联苯肼酯、腈吡螨酯等的抗性为低抗到中抗水平[9，21]，但本研究中测试种群的抗药性明显上升；虽然联苯肼酯、腈吡螨酯制剂仍对多地的二斑叶螨种群防效优良[33-34]，然而，在二斑叶螨的防控中，要特别关注科学轮换用药及综合防治，延缓二斑叶螨对这些高效药剂的抗性发展速度。