北疆棉花黄萎病发病率调查及土壤中黄萎病菌微菌核数量与种群类型分析

刘海洋　王伟　张仁福等

关键词 棉花黄萎病；大丽轮枝菌；微菌核；落叶型菌株

中图分类号：S 435.621.24 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022318

2021年新疆棉花种植面积占全国的82.8%，总产量占全国的89.5[1]，保障新疆棉花生产安全对于稳定全国棉花供给意义重大。然而，由于新疆棉花规模化种植，常年连作加重了棉花黄萎病的危害。多年流行学调查显示，不同棉花种植区域黄萎病发生程度差异显著。如，2015年巴楚县、五家渠市、莎车县等地发病棉田百分率分别为37.5%、21.7%和18.8%；图木舒克市、沙雅县一新和县一庫车县、库尔勒市一尉犁县一轮台县、沙湾县一奎屯市等地发病棉田百分率均超过50%；阿克苏地区、石河子市一玛纳斯县一呼图壁县、乌苏市一精河县一博乐市等地发病棉田百分率均超过70[2]。发病严重地区可造成棉花减产30%以上[3]，成为制约新疆棉花可持续生产的重要因素。

国内棉花黄萎病的病原菌主要为大丽轮枝菌Verticillium dahliae，形成的休眠结构微菌核在土壤中可存活14年以上[4]，分泌的毒素可直接引起棉花叶片萎蔫坏死，最终造成棉株死亡。大丽轮枝菌种群演化机制复杂，进化出了多元的种群结构。根据对棉花致病的严重程度和症状类型，将大丽轮枝菌分为落叶型和非落叶型两种致病型，落叶型菌株的致病性强于非落叶型菌株[5-6]，落叶型菌株引发的黄萎病病情发展迅速，严重时常导致棉花大面积光秆，危害很大[7]。土壤中微菌核的数量与棉花的生长季节有一定相关性，亦与棉花黄萎病发生趋势高度一致[8]。但是，不同棉区生态环境、种植棉花品种等存在较大差异，可能引起棉花黄萎病发生程度的差异。常年棉花连作又进一步加重了土壤棉花黄萎病菌的积累和变异分化。如，2004年新疆棉区强致病力落叶型黄萎病菌菌株存在比例很低[9]，而目前局部地区落叶型菌株已占80%以上，甚至100[10]。但目前新疆棉花黄萎病相关研究主要集中在分离自棉株的黄萎病菌上，并未对新疆棉田土壤中黄萎病菌种群进行系统研究。

快速定量土壤中黄萎病菌的微菌核数量，明确棉田土壤中黄萎病菌落叶型和非落叶型菌株的分布状况，对研究新疆棉花黄萎病流行演替规律及制定综合防治措施具有重要意义[11]。因此，本文对北疆主要植棉地区棉田黄萎病发生情况、土壤中微菌核数量及黄萎病菌种群类型进行了调查研究，以期更好地指导新疆棉花黄萎病防控，保护新疆棉花生产安全。

1材料与方法

1.1棉花黄萎病发生情况调查

2021年7月25日开始对呼图壁县、玛纳斯县、石河子市、沙湾县、奎屯市、乌苏市、精河县、博乐市8地共计199块棉田棉花黄萎病发生情况进行了抽样调查，按调查先后顺序进行编号。每块棉田选择与田埂直线距离约100 m处设第1调查取样点，以50 m距离为间隔在第1点侧边依次设置第2、3调查取样点，每点连续调查50株棉花，每块棉田共计调查150株，计算发病率。

发病率=（发病株数／调查总株数）×100%。

1.2棉田土壤采集

采集发病调查点棉株根围5～10cm耕层土壤，每点采集200g土壤，每块棉田采集3个样点，共600g土壤，装入封口袋，做好标记，用于分离土壤中的黄萎病菌，并检测统计微菌核数量，同时采集部分未发病调查点土壤进行黄萎病菌分离验证。共计采集172份土壤，阴凉处晾干后保存于4℃冰箱备用。

1.3土壤中棉花黄萎病菌微菌核分离

将1.2中保存的晾干土壤样品过30目筛，称取6g放入盛有200 mL灭菌水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，静置5 min，120r/min振荡20 min。然后倒入上层100目，下层400目的细筛，在自来水下将泥土冲洗干净。留在下层筛网上的土壤残留物全部转移到100 mL三角瓶中，用无菌水定容到30 mL，用移液枪每次吸取1mL均匀涂布于选择性培养基（MSN） [12]表面，接种5皿，待培养基上的土样液晾干后，密封在28℃下黑暗培养7d。每5皿的检验结果数目之和就是所测1g土样中所含微菌核数量。3次重复。

1.4土壤中棉花黄萎病菌纯化

挑取步骤1.3 MSN培养基上生长的黄萎病菌菌落，在试管中充分研磨后加入10 mL无菌水稀释10倍，再利用梯度稀释法依次稀释至104倍。利用移液枪吸取500μL的最终稀释液均匀涂布于MSN培养基平板上，重复5次。在25℃培养箱培养5d左右，待平板上长出黄萎病菌单菌落后，使用接种针将单菌落接种在PDA培养基中央，置于25℃相对湿度50%的培养箱内，培养7d，待菌落长满平板后，观察棉花黄萎病菌的生长形态特征。

1.5棉花黄萎病菌菌株落叶型与非落叶型检测

挑取纯化后的棉花黄萎病菌菌块，接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，培养10～20 d后，刮取玻璃纸表面生长的菌丝至滤纸上进行烘干后，移至离心管中加入钢珠和液氮，使用全自动样品快速研磨仪研磨，再用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取棉花黄萎病菌菌株的基因组DNA。

利用棉花黄萎病落叶型菌株特异性引物D1：5′-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3′，D2：5′-GA-CACGGTATCTTTGCTGAA-3′;非落叶型菌株特异性引物ND1： 5′-CAGGGGATACTGGTACG-AGACG-3′， ND2： 5′-ATGAGTATTGCCGATA-AGAACA-3′[13]，对棉花黄萎病菌进行PCR扩增，上述引物均由北京新时代众合科技有限公司合成。

反应体系25μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，上、下游引物各0.5μL，ddHO10.5μL。扩增程序：94℃预变性5 min; 94℃变性1 min，56。C退火1 min，72℃延伸3 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照。

1.6数据分析

利用Excel软件对调查数据进行统计和作图，并利用其中的Correl函数进行相关性分析。

2结果与分析

2.1北疆棉区棉花黄萎病发生情况

棉花黄萎病调查结果显示，2021年北疆抽样棉田中，无病田98块，占调查棉田的49.2%；0%≤发病率<5.0%的棉田65块，占32.7%；5%≤发病率<10%的棉田8块，占4.0%；10%≤发病率<20%的棉田10块，占5.0%；20%≤发病率<30%的棉田为10块，占5.0%；发病率≥30%的棉田8块，占4.0%。分析发现，北疆棉区棉田以无病田和发病率<5.0%的病田为主，共占81.9%。

与2013年[14]、2015年[15]同期调查结果（已另文发表）进行比较分析，2013年、2015年北疆无病棉田分别占31.6%和36.6%，而2021年无病棉田占49.3%，2021年无病田率分别较2013年、2015年增加17.7和12.7百分点。2013年、2015年发病率≥5%的棉田分别占33. 7%和39. 6%，而2021年发病率≥5%的棉田占18.0%，2021年发病率≥5%的棉田分别较2013年、2015年减少15.7和21.6百分点。北疆棉区发病严重棉田占比在2015年处于最高点，尤其发病率≥30%的严重棉田占比达11.2%.比2013年、2021年分别高111.3%、180.0%（图1）。至2021年，北疆棉区无病田增多，严重发病田减少，棉田发病有所减轻。

2.2棉田发病情况与微菌核数量的相关分析

整体来看，北疆棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的线性方程为y=151.24x+3.4504，相关系数R=0.1191，相关性不显著。分区域来看，呼图壁一玛纳斯片区整体发病较轻（图2），该片区7号棉田每克土壤（干重，下同）中微菌核数量最高，达63.7个，发病率为12.5%；11号棉田发病率为25.0%，但其每克土壤中微菌核数量为30.7个，低于7号棉田；8号棉田发病率为3.5%，每克土壤中微菌核数量为15.3个；9号棉田为零星发病田（发病率<0.1%），每克土壤中微菌核数量为3.7个。分析发现，呼图壁-玛纳斯片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数为0.6357，两者呈中度正相关。部分发病率低的棉田土壤中微菌核的数量反而比发病率高的棉田多，可能与种植品种的抗病性差异有关。

石河子一沙湾片区79、66、43号棉田土壤中微菌核数量较多，每克土壤中分别为120.0、100.3、46.7个，但是对应棉田的发病率较低，分别为5.0%、12.5%、0.5%。26、49、32号棉田为零星发病田，但是每克土壤中微菌核数量高达49.3、46.7、45.7个（图3）；而71、62、57、27、56、81号棉田的发病率较高，分别为42.5%、40.0%、30.0%、25.0%、20.0%、15.0%，但是对应棉田土壤中微菌核的数量反而偏少，每克土壤中分别为30.3、21.0、15.7、2.7、16.7、16.0个。分析表明，石河子一沙湾片区棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的相关系数为0.0332，两者无显著相关，可能主要与种植品种的抗病性差异有关。

奎屯一乌苏片区棉花黄萎病整体发生较轻（图4）。96、139号棉田发病率较高，分别为22.5%、20.0%，每克土壤中微菌核数量分别为3.3、17个；118号棉田每克土壤中微菌核数量高达42个，而发病率却仅为4.0%。分析表明，奎屯一乌苏片区棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的相关系数为0.0076，两者无显著相关。

精河一博乐片区197、193、147号棉田发病率较高（图5），分别为40.0%、30.0%、30.0%，每克土壤中微菌核数量分别为16.3、20.0、12.7个；而发病率相对较低的194、144、157号棉田发病率分别为25.0%、20.0%、9.0%，对应棉田每克土壤中微菌核数量较高，分别为51.3、28.0、43.7个。分析表明，精河一博乐片区棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的相关系数为0.0623，两者无显著相关。

2.3土壤中棉花黄萎病菌的生长类型

从不同区域棉田土壤中共分离到195株棉花黄萎病菌，按其产生微菌核数量的多少分为菌核型、中间型、菌丝型3种类型。菌核型菌株能产生大量黑色的微菌核，该类菌株有113株，占57.9%；中间型菌株气生菌丝少，环边缘均匀产生少量微菌核，该类菌株有37株，占18.9%；菌丝型菌株表面产生浓密的白色菌丝，长时间培养不产生微菌核，该类菌株有45株，占23.2%。北疆棉田土壤中棉花黄萎病菌以菌核型为主。

2.4土壤中黄萎病菌菌株落叶型与非落叶型检测

两组特异性引物检测结果显示（图7），利用落叶型特异引物D1／D2从195株棉花黄萎病菌中扩增到190株含有550bp的落叶型特异性条带，判定为落叶型菌株，占97.4%，利用非落叶型引物NDl/ND2仅扩增到5株黄萎病菌含有1500 bp的非落叶型特异性条带，判定为非落叶型菌株，占2.6%。检测结果表明，目前北疆棉田土壤中的棉花黄萎病菌以落叶型菌株占绝对优势。

3结论与讨论

棉花黄萎病是现阶段严重威胁新疆棉花生产安全的首要病害。2021年调查发现，北疆棉区棉田以无病田与零星病田为主，与2013、2015年同期相比，无病田与零星病田比例增多，严重发病棉田大幅减少。北疆棉区发病严重棉田在2015年处于高点，至2021年棉田发病减轻，可能与近年来大力推广种植抗病棉花品种有关，因此在传统植棉区棉花黄萎病发病严重区域应加大抗病棉花品种的研发与推广工作。

土壤中的微菌核是棉花黄萎病的主要侵染源，其数量与棉花黄萎病发生严重程度呈正比[16]，土壤中的微菌核数量随着棉花连作年限的延长而增加[17]，而种植感病棉花品种能促进微菌核迅速增长[18]。微菌核在土壤中主要呈聚集分布，主要分布在0～20 cm的耕层中[19]，占0～40 cm耕层中总量的79.9%，其中0～10 cm耕层中微菌核数量最多[20]，在土壤中能存活10年之久[21]。但2021年调查发现，整体上北疆棉区棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量无显著相关，分区域来看，呼图壁一玛纳斯片区棉田发病率与土壤微菌核数量呈中度正相关，而石河子-沙湾片区、奎屯-乌苏片区、精河-博乐片区棉田发病率与土壤微菌核数量均无明显相关。推测出现这种现象的原因主要与种植棉花品种抗病性以及土壤中棉花黄萎病菌致病力有关，当区域种植的棉花品种抗病性一致、病原菌致病力一致的情况下，棉田黄萎病发生程度与土壤中微菌核数量呈正相关，但是当重病田改种抗病品种时，使得原本的重病田发病率降低，导致棉田土壤微菌核数量与发病率的相关性不显著。另外，棉田采集的土壤样本数量偏少及土壤中微菌核的区域分布差异，亦可能对分析结果产生影响，需加强该方面的监测研究工作。

李国英等[22]的研究表明，新疆棉株中分离到的黄萎病菌以菌核型为主，中间型和菌丝型菌株为辅。但是，袁洪波等[23]发现石河子棉区棉株中分离到的黄萎病菌以菌丝型为主，占60%；而惠慧等[24]研究发现北疆棉区棉株中分离到的黄萎病菌均为菌核型，后两者的研究结果差异较大，充分表明新疆不同棉区的棉花黄萎病菌存在明显的形态差异，多样性丰富。本文发现，目前北疆棉区土壤中分离到的棉花黄萎病菌以菌核型为主。大丽轮枝菌种群复杂，具有落叶型／非落叶型、不同营养亲和群、交配型等种群结构。其中，落叶性状是大丽轮枝菌种群演化的重要类型，落叶型菌株的致病力明显高于非落叶型[25]。新疆棉区2004年发现少量落叶型菌株[26]，2006年时落叶型菌株占8.6%[9]，至2008年—2013年新疆落叶型菌株已占30%以上[25，27]，2017年北疆棉区落叶型菌株已占76.5%[19]，2019年蔡梦杭等从北疆棉田病株上分离到的644株大丽轮枝菌中67.5%为落叶型菌株[28]，徐灿等[11]采集的208份土壤样品中检测到含有落叶型菌株的占98.6%。至2021年惠慧等发现南疆棉区、北疆棉区及东疆棉区中落叶型菌株分别达到82.14%、53.33%和100%[10]。本文发现，从土壤中分离到的195株棉花黄萎病菌中落叶型菌株占97.6%，與徐灿等[11]的研究结果较为一致。研究表明，随着种植棉花年限的延长，目前北疆棉田土壤中黄萎病菌落叶型菌株占绝对优势。

综合来看，2021年北疆棉区棉花黄萎病发生较2015年减轻，土壤中棉花黄萎病菌生长类型以菌核型为主，落叶型菌株占绝对优势，但田间发病棉株未表现出叶片严重脱落症状，可能是抗病棉花品种的大力推广种植增强了棉花抵御黄萎病危害的能力。