外源ACC通过激活乙烯合成及信号转导诱导小豆抗锈性

章国庆　殷丽华　孙治国等

关键词 小豆； 豇豆单胞锈菌； 诱导抗性； 乙烯信号通路； 活体营养型真菌

中图分类号： Ｓ４３５．２１ 文献标识码： Ａ DIO： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２３１６

小豆Vigna angularis是我国传统的杂粮作物， 大约于１２０００年前起源于中国［１］，至今已有近千年的栽培历史。小豆因适应性广、耐瘠薄、可固氮养地等优点［２］，常以混／間作或轮作的方式改善土壤氮素状况，在现代种植业结构调整中发挥重要作用。黑龙江省作为我国最大的小豆产区，年均产量占国内总产量的４２．８２％［３］。然而，由活体营养型真菌豇豆单胞锈菌Uromyces vignae引起的小豆锈病［４］，近年来在黑龙江省各小豆产区严重发生，导致叶片提前脱落和植株早衰，严重影响小豆的产量和品质。培育抗病品种，合理利用品种抗性是防治作物锈病最为经济有效的措施。植物抗病性通常源于其自身抗性和外界因素的诱导，后者即为诱导抗性，水杨酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）、乙烯（ｅｔｈｙｌｅｎｅ，ＥＴ）、茉莉酸（ｊａｓｍｏｎｉｃａｃｉｄ，ＪＡ）等植物类激素作为抗病诱导剂已被广泛应用［５６］。课题组前期研究发现，外源１-氨基环丙烷-１-羧酸（１-ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ-１-ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，ＡＣＣ）、ＳＡ、茉莉酸甲酯（ｍｅｔｈｙｌｊａｓｍｏｎａｔｅ，ＭｅＪＡ）等可显著提高小豆抗锈性，其中ＡＣＣ的诱抗效果最好［７］。

植物内源乙烯的合成始于甲硫氨酸（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍｅｔ），Ｍｅｔ在犛腺苷甲硫氨酸合成酶（S-ａｄｅ-ｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＤＳ）的催化下生成犛腺苷甲硫氨酸（S-ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＡｄｏＭｅｔ），随后ＡｄｏＭｅｔ在ＡＣＣ合酶（１-ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ-１-ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＣＳ）的作用下形成乙烯前体ＡＣＣ，ＡＣＣ 最终在ＡＣＣ 氧化酶（ＡＣＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＣＯ）的作用下生成乙烯［８］，ＡＣＳ将ＡｄｏＭｅｔ转化为ＡＣＣ是乙烯生物合成的第一步，也通常被认为是乙烯生物合成的限速步骤［９］。植物内源乙烯形成后，首先和位于内质网上的ＥＴＲ１ （ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅ-ｓｐｏｎｓｅ１）等受体结合，导致ＣＴＲ１（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｔｒｉ-ｐｌｅｒｅｓｐｏｎｓｅ１）蛋白失活，进而诱发ＥＩＮ２（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ２）去磷酸化，随后ＥＩＮ２的Ｃ末端结构域被释放进入细胞核，在核内激活转录因子ＥＩＮ３（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ３）和乙烯不敏感样蛋白１（ＥＩＮ３-ｌｉｋｅ１，ＥＩＬ１），进而激活下游乙烯应答转录因子（ｅｔｈｙｌｅｎｅ-ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒ，ＥＲＦｓ）的表达，ＥＩＮ２和ＥＩＮ３在乙烯信号通路中发挥核心正调控作用［１０］。外源ＡＣＣ则可通过激活乙烯信号通路在植物免疫中发挥功能。如外源ＡＣＣ可诱导湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY1基因在叶、茎和根中显著上调表达，同时诱导苹果对轮纹病菌Botryo-sphaeria dothidea的侵染产生抗性，而MhWRKY1在乙烯介导的抗病信号转导中发挥重要作用［１１］。此外，１００μｍｏｌ／ＬＡＣＣ也可通过诱导番茄中Solanum lycopersicum乙烯应答转录因子ＥＲＦ 家族基因SlERF.A1、SlERF.A3、SlERF.B4和SlERF.C3等的表达，提高番茄对灰霉病菌Botrytis cinerea的抗性［１２］。乙烯调节植物抗性与其信号通路下游乙烯应答转录因子的激活密切相关。如小麦Trutucyn aestuvum中乙烯应答转录因子TaPIE1的表达受病菌侵染的诱导，并通过调节乙烯信号通路下游防卫相关基因（PR２、PR4、PR１０等）的表达正调控小麦对纹枯病菌Rhizoctomia cerealis的抗性［１３］。在大豆Glycine max中过表达GmERF5基因，可显著诱导防卫反应基因PR１０、PR１-１和PR１０-１等的表达，提高大豆对大豆疫霉Phytophthoru sojae的抗性［１４］。上述研究表明，ＡＣＣ诱导的植物对死体营养型病原菌的抗性与乙烯信号通路的激活密切相关，这与长期以来认为乙烯信号通路主要参与植物应答死体或半活体营养型真菌的观点一致［１５１６］。然而，近年来的研究发现，乙烯信号通路在小麦应答白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici侵染中同样发挥重要作用。如异位表达乙烯应答转录因子ERF1-V可显著提高小麦对白粉菌的抗性［１７］。另有研究表明，小麦TuMYB４６L-TuACO3犔犜狌犃犆犗３互作调控乙烯合成，进而提高小麦对白粉病的抗性［１８］。显然，乙烯信号通路在植物应答活体营养型真菌中也同样发挥重要的调控作用。

外源ＡＣＣ可诱导小豆抗锈性。为深入解析乙烯合成及其信号转导在ＡＣＣ诱导小豆抗锈病中的作用，本研究应用外源ＡＣＣ激发处理小豆真叶，于处理后不同时间采用ＲＴ-ｑＰＣＲ 技术分析小豆内源乙烯合成及信号通路关键基因的表达模式，进一步于ＡＣＣ激发处理后挑战接种锈菌，分析接种后不同时间乙烯信号通路下游防卫反应基因的表达模式，旨在为深入探索ＡＣＣ诱导植物抗病的分子机理提供参考，为解析乙烯信号通路在植物抵抗活体营养型真菌中的作用提供新证据。

１材料与方法

１．１供试材料

小豆高感锈病品种‘宝清红’（ＢＱＨ）由黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术中心种质资源研究室提供；豇豆单胞锈菌分离株ＺＸＬ０１，由黑龙江八一农垦大学植物免疫研究室分离纯化。

１．２供试植株培育

挑选籽粒饱满无病的ＢＱＨ 种子，预先在２５℃恒温培养箱中催芽，待种子萌动后，种植于直径１６ｃｍ 的营养钵内，置于昼（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期为Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的温室内培养，待小豆真叶展开度达６０％～７０％时备用。

１．３试验方法

１．３．１ ＡＣＣ处理及样品采集

选取长势一致的小豆幼苗，参考康静等［７］的方法，以０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ（源叶生物科技有限公司）处理小豆真叶，喷施量以叶片表面润湿但不成股流下为准，以喷施无菌水为对照，处理后置于（２５±２）℃的保湿桶内培养１２ｈ，随后将植株置于昼（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期为Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的温室内继续培养。处理后每天观察小豆植株的形态，同时于处理后０、２、３、４ｄ和７ｄ分别取样，每处理３次重复，每重复选取４株，样品经液氮速冻后－８０℃保存备用，用于乙烯合成（VaACS1）及乙烯信号通路关键基因（VaE1N2、VaE1N3和VaERF5）的表达分析。

１．３．２ ＡＣＣ激发处理与锈菌挑战接种

按１．３．１的方法，采用０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ激发处理小豆真叶，激发处理后２ｄ参考郑素娇等［４］的方法，用１×１０ 个／ｍＬ的夏孢子悬浮液，喷雾法进行挑战接种，喷施量以叶片表面润湿但不成股流下为准，以ＡＣＣ激发处理后接种无菌水为对照，同时设置水处理（未激发）接种锈菌和水处理（未激发）不接种的对照。接种后将小豆植株置于（２０±２）℃的保湿桶内黑暗培养２４ｈ，随后将植株置于昼（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期为Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的温室内继续培养，于接种后１２ｄ参考Ｓｔａｖｅｌｙ［１９］的方法，分析不同处理小豆叶片的发病情况和夏孢子堆产生情况，明确ＡＣＣ激发处理对小豆抗锈性的影响。于挑战接种后０、０．５、１、２、５ｄ和８ｄ取接种的真叶，每处理３次重复，每重复选取４株，样品经液氮速冻后－８０℃保存备用，用于防卫反应基因犞犪犘犚２和犞犪犘犚４的表达模式分析。

１．３．３小豆样品总ＲＮＡ 提取及基因表达分析

采用ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）法提取各样品总ＲＮＡ，并用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）合成ｃＤＮＡ。参考Ｃｈｉ等［２０］的方法，以VaACT为内参基因，参考ＴＨＵＮ-ＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲＧｒｅｅｎ试剂盒说明书进行ＰＣＲ扩增。实时荧光定量ＰＣＲ 反应体系（１０μＬ）：ＳＹＢＲＰｒｅｍｉx Ｅｘ Taq５．０μＬ，上、下游引物各０．５μＬ，模板ｃＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨＯ 补足１０μＬ。扩增在ＣＦＸ９６实时荧光定量ＰＣＲ 仪上进行，反应程序：９５℃预变性１ｍｉｎ；９５℃变性１５ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０个循环。每處理重复３次，采用２犆狋法［２１］计算基因的相对表达量。本研究分析的基因及其引物见表１，引物由赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成。

１．３．４数据处理

数据统计分析采用ＳＰＳＳ２２．０软件进行，所得数据均用平均值±标准误差表示，采用独立样本狋测验和单因素方差分析比较差异显著性（α＝０．０５）。

２ 结果与分析

2．１外源犃犆犆处理对小豆生长及乙烯合成和信号通路基因表达的影响

以高感锈病小豆品种ＢＱＨ 为材料外源喷施０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ，处理后２ｄ小豆幼苗顶端出现明显的弯钩（图１），顶端弯钩加剧是植物应答激素乙烯的“三重反应”之一［２２］。进一步利用ＲＴ-ｑＰＣＲ分析不同处理乙烯生物合成关键基因犞犪犃犆犛１的表达情况，结果表明，ＡＣＣ处理后２ｄ，VaACS1的表达量显著升高，并持续升高至处理后４ｄ，处理后７ｄ，ＶａＡＣＳ１的表达量虽有所下降但仍显著高于对照（图２ａ）。对乙烯信号通路关键基因VaEIN２、VaEIN3和VaERF5的表达分析发现，VaEIN２的表达同样受外源ＡＣＣ 的诱导，于ＡＣＣ 处理后２ｄ显著升高，处理后３ｄ表达量达到峰值，随后有所下降，但到处理后７ｄ仍显著高于对照（图２ｂ）；VaEIN3表达水平的变化趋势和VaEIN２类似，处理后２ｄ显著上调表达，处理后４ｄ达到峰值后下降，至处理后７ｄ表达量仍显著高于对照（图２ｃ）；VaERF5作为乙烯信号通路下游的乙烯应答转录因子，其显著上调表达的时间稍有滞后，于处理后３ｄ表达量显著升高达到峰值，处理后４ｄ表达量虽有所下降但仍显著高于对照，至处理后７ｄ再次下降后显著低于对照（图２ｄ）。

２．２外源犃犆犆激活防卫反应基因的表达，参与小豆抗锈性

ＡＣＣ激发处理后２ｄ挑战接种豇豆单胞锈菌，接种后１２ｄ，未激发处理接种的小豆真叶发病严重，叶片表面布满褐色夏孢子堆（图３ａ），ＡＣＣ激发处理后２ｄ挑战接种的叶片发病则明显减轻（图３ｂ）。对不同处理叶片表面夏孢子堆数的统计结果表明（图３ｃ），ＡＣＣ 激发处理后挑战接种的叶片夏孢子堆数仅为９．９１个／１．５ｃｍ，显著低于对照处理的４０．６２个／１．５ｃｍ。

在明确ＡＣＣ显著提高小豆抗锈性的基础上，应用ＲＴ-ｑＰＣＲ技术分析了ＡＣＣ激发处理后２ｄ挑战接种豇豆单胞锈菌的叶片防卫反应基因表达模式。结果表明，水处理（未激发）后接种锈菌的叶片中，VaPR2的表达水平总体偏低，接种后０．５ｄ和１ｄ的表达量显著低于水处理不接种的对照，但水处理接种锈菌后５ｄ和８ｄ，VaPR2的表达水平升高，显著高于水处理不接种对照（图４）。此外，ＡＣＣ激发处理２ｄ后挑战接种的叶片中，VaPR2的表达量于接种后１ｄ即显著升高达到峰值，随后虽有所下降，但与ＡＣＣ激发后不挑战接种的处理比，VaPR2仍维持较高的表达水平。

VaPR4表达分析的结果表明，在水处理接种锈菌的叶片中，除接种后０．５ｄ外，VaPR4在接种后不同时间的相对表达水平与水处理未接种对照间均无显著差异（图５）。而ＡＣＣ激发后挑战接种的叶片中，VaPR4的总体表达水平较高，且自挑战接种锈菌后１ｄ开始，其相对表达量即显著高于水处理不接种、水处理接种及ＡＣＣ激发不挑战接种等处理，VaPR4的表达峰值出现在ＡＣＣ激发挑战接种后第８天（图５）。

比较分析VaPR2和VaPR4在不同处理条件下的相对表达水平发现，ＡＣＣ激发处理后挑战接种锈菌，VaPR4响应锈菌侵染时的表达水平更高，应答更为及时。

３结论与讨论

植物诱导抗性是一种普遍存在的由植物基因调控的特性，越来越多的研究证实通过生物或化学诱导因子提升植物抗性是防治植物病害的一种有效途径［２３］。研究表明，在植物培养基中添加ＡＣＣ 可诱发植物表现顶端弯钩加剧、下胚轴增粗和茎伸长被抑制等乙烯“三重反应”［２４］。本研究发现，外源ＡＣＣ激发处理后２ｄ即观察到小豆幼苗出现明显的顶端弯钩加剧现象，对VaACS1基因的表达分析发现，外源ＡＣＣ 诱导VaACS1显著上调表达，表明外源ＡＣＣ促进了小豆内源乙烯的合成。进一步分析发现，外源ＡＣＣ 同时诱导了VaEIN２、VaEIN３ 和VaERF５表达水平显著上调，表明ＡＣＣ激活了小豆乙烯信号通路。乙烯信号级联的下游，乙烯应答转录因子（ＥＲＦ）家族成员在植物防御调节中发挥主导作用。如在拟南芥Arabidopsis thaliana中过表达或沉默ＥＲＦ转录因子，可提高或抑制拟南芥对灰葡萄孢Botrytis cinerea、尖镰孢Fusarium oxysporum等真菌的抗性［２５］。在烟草中过表达NtERF5可显著提高烟草对烟草花叶病毒（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）的抗性［２６］。综上所述，外源ＡＣＣ 激活了小豆乙烯信号通路，并可能通过ＥＲＦ转录因子调控小豆抗锈性。然而，一般认为乙烯信号通路主要在植物对死体或半活体营养型真菌抗性中发挥功能［２７］。且有研究发现，乙烯不仅无法诱导烟草对白粉菌Oidium neolycopersici产生抗性，还会导致番茄对活体营养型卵菌烟草霜霉Peronospora tabacina更加敏感［１５］。但近期的一項研究发现，小麦ＭＹＢ转录因子TuMYB46L可与TuACO3互作促进乙烯的合成，进而提升一粒小麦Triticum monococcum对白粉菌B.graminis f.sp.tritici的抗性［１８］，说明乙烯信号通路在植物应答活体营养型真菌中同样发挥重要的调控作用。

乙烯信号通路调控植物抗性最终是通过诱导多种防卫反应基因的表达实现的，包括病程相关蛋白编码基因PR1-5、PR12-13等［１６］，且PR4的表达可能依赖乙烯信号通路［２８］。本研究分析表明，先用ＡＣＣ激发后再接种锈菌，VaPR2和VaPR4的表达量在锈菌侵染早期即显著升高，并始终维持较高水平。与本研究相似，在小麦-白粉菌互作体系中，外源乙烯同样可诱导小麦几丁质酶基因（PR４）的表达提升几丁质酶活性，进而诱导小麦对白粉菌的抗性［１８］。除PR４外，乙烯也可显著提高豆科植物叶片中β-１，３-葡聚糖酶基因（PR２）的表达［２９］。上述结果说明，ＡＣＣ处理可激活小豆内源乙烯信号通路，诱导下游ＥＲＦ转录因子的表达，最终促进防卫反应基因的表达，诱导小豆抗锈性。

然而，课题组前期采用乙烯信号通路抑制剂１-甲基环丙烯（１-ＭＣＰ）和ＡＣＣ共同激发处理小豆，２ｄ后挑战接种锈菌，发现１-ＭＣＰ抑制了小豆幼苗的“三重反应”，但不能完全抑制ＡＣＣ诱导的抗性，因而推测ＡＣＣ诱导抗锈性部分依赖乙烯信号通路［７］。这一结论与本研究不完全一致，其可能原因是１-ＭＣＰ处理２ｄ仅能部分抑制乙烯，当１-ＭＣＰ解除后小豆可恢复乙烯敏感性。如１-ＭＣＰ处理苹果可显著减少乙烯的生成，从而延迟果实成熟［３０］，但１-ＭＣＰ对梨和桃成熟的抑制作用仅在１-ＭＣＰ熏蒸时有效，一旦１-ＭＣＰ 解除则果实会迅速软化［３１］。其机理可能是１-ＭＣＰ会诱发植物形成新的乙烯受体，从而在１-ＭＣＰ解除后恢复对乙烯的敏感性［３０］。

综上所述，本研究初步证实了外源ＡＣＣ通过激活乙烯信号通路促进防卫反应基因表达，进而提高小豆的抗锈性。研究结果丰富了乙烯信号通路调控植物应答活体营养型真菌的分子证据，但有关外源ＡＣＣ诱导植物免疫的分子机制，以及乙烯信号通路在植物应答不同营养类型病原菌中的调控机理仍需进一步试验验证。