基于网络药理学及分子对接探析“黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的作用机制※

王梦诗,郭 玲,何学红

(1.辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 116600;2.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110000)

慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)是因各类慢性肾脏病持续进展至后期,肾实质发生损害,出现水电解质及代谢产物紊乱、酸碱平衡失调等全身各系统症状的一种临床综合征。慢性肾脏病对人类健康有较大威胁,西医对本病的治疗以透析为主,但不良反应较为明显,故在疾病发展早期应用中医药延缓疾病进程十分必要。

辽宁省名中医何学红教授师承全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师郭恩绵,其认为CRF是由于脾肾受损,湿浊毒邪内蕴,使五脏虚损,气血阴阳不足所致,针对本病临床表现及病机提出补益脾肾、活血祛瘀利水的治法,沿用参芪泄浊饮分期而治,临床疗效显著[1]。“黄芪-太子参-陈皮”为郭恩绵教授补脾常用药对[2],符合张仲景《伤寒论》中对角药的描述,3味药物四气五味相互融合,可增强疗效[3]。本研究期望从网络药理学的角度阐释参芪泄浊饮中健脾益气的药物“黄芪-太子参-陈皮”与CRF 间的关联性,挖掘其通过何种途径发挥治疗作用,以期为后续临床应用中医药治疗CRF提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 “黄芪-太子参-陈皮”活性成分及靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索3味中药的组成成分。设置口服生物利用度≥30%,类药性≥0.18,根据药物代谢动力学(ADME)参数筛选获得药物主要有效成分,并预测活性成分相关靶点,导入Uniprot数据库,明确各蛋白匹配的基因名称。

1.2 筛选CRF 靶点基因 以“慢性肾衰竭”“chronic renal failure”为关键词,在 Genecards 数据库、Drugbank数据库、OMIM 数据库收集CRF 靶点基因。由于Genecards数据库结果过多,故以Relevance score＞中位数为基准,进行3 次筛选大于中位数的疾病靶点,最后合并3 个数据库的靶点基因进行去重。

1.3 获取药物与疾病的共同靶点 将得到的“黄芪-太子参-陈皮”活性成分靶点基因和CRF 靶点基因输入Bioinformatics平台,得到两者交集靶点,构建韦恩图。

1.4 构建蛋白质相互作用(PPI)网络 将1.3获取的交集靶点基因提交STRING 11.0数据库,设置物种类别为“Homo sapiens”,构建PPI网络模型。

1.5 GO、KEGG 通路富集分析 应用Metascape分析平台对交集靶点进行京都基因组与基因组百科全书(KEGG)富集分析和基因本体(GO)分析,计算P-value值,对目的基因进行排序,得到信号通路、生物过程(BP)、细胞组成(CC)及分子功能(MF)等信息。筛选前20 个结果,在Bioinformatics网站制作气泡图。

1.6 构建“药物活性成分-疾病靶点-通路”网络 输入筛选完成的交集靶点的成分、靶点及KEGG 富集通路,在Cytoscape 3.8.2 构建“药物活性成分-靶点-通路”网络图。根据网络拓扑学参数分析各节点Degree值、介度及紧密度,得出发挥主要药效的成分。

1.7 分子对接验证 通过TCMSP数据库检索1.6中得到的核心成分化学结构,自PDB蛋白质数据库下载核心靶点蛋白的3D 结构。在Py Mol软件对蛋白结构去水及残基处理,导入AutoDock Tools 加氢。在AutoDock Vina中对核心成分和靶点分别进行对接,选取最优结合能构象与靶点蛋白对接,结果导入Python-Pymol 2.2.0。

2 结果

2.1 药物活性成分及靶点筛选 在TCMSP 数据库初步收集黄芪活性成分87 种,太子参75 种,陈皮5种,根据ADME 值及相关文献再次筛选后,最终得到黄芪活性成分17种,太子参6种,陈皮5种,见表1(黄芪节选前10位活性成分)。筛选出的黄芪活性成分靶点379个,太子参108个,陈皮79个,去除三者重复值,最终保留角药活性成分靶点共232个。

表1 “黄芪-太子参-陈皮”角药活性成分(黄芪选取排名前10位成分)

2.2 药物与疾病交集靶点的获取 自Genecard数据库共收集疾病靶点基因4 597个,3次筛选Relevance score＞中位数的基因,获得CRF 靶点基因575个,合并Drugbank、OMIM 数据库并去重,最终保留1 145个靶点基因。输入Bioinformatics平台,共获得药物活性成分与疾病交集靶点75个,见图1。

图1 “黄芪-太子参-陈皮”角药-慢性肾衰竭疾病靶点韦恩图

2.3 药物治疗CRF的PPI网络的构建 在STRING平台输入2.2 中得到的交集靶点,绘制PPI网络,见图2。应用Cytoscape 3.8.2 绘制更为清晰的PPI网络,见图3。此网络包含73个节点和1 335条连线,节点面积大,颜色深,则越重要。根据Degree值由高到低排序,前5 位为IL6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53,分别是64、64、63、61、60,这些靶点则预测为“黄芪-太子参-陈皮”治疗CRF的关键靶点。

图2 “黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的靶点蛋白质相互作用图

图3 “黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的靶点高级蛋白质相互作用图

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用Metascape进行富集分析,分别得到169 条KEGG 富集通路,细胞组分(CC)51个条目,分子功能(MF)99个条目,生物过程(BP)1 427个条目,参考Metascape平台分析结果,均取前20 个,在Bioinformatics 绘制KEGG、GO 气泡图。图左侧为富集名称,气泡大小与该通路的基因计数呈正相关,横轴为输入基因占该通路基因的比值。KEGG 富集分析结果包含HIF-1 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路等。GO 功能分析结果中,CC主要有膜筏、囊腔、细胞溶脂等,MF 主要有酶结合、蛋白质同型二聚体活性等,BP主要有凋亡信号通路、对脂多糖的反应等。见图4。

图4 “黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的京都基因组与基因组百科全书(KEGG)富集分析及基因本体(GO)分析

2.5 构建“药物活性成分-疾病靶点-信号通路”网络图 将“黄芪-太子参-陈皮”药物活性成分、交集靶点、KEGG 富集通路,传至Cytoscape绘制网络图,见图5。结果反映药物治疗CRF 呈多成分、多靶点、多通路的机制。通过Network Analyzer内置插件对结果进行拓扑学分析,最终预测得出活性核心成分、核心靶点。活性核心成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚,Degree值为61、28、22,核心靶点是PTGS2、RELA、AKT1,Degree值为23、18、16。

图5 “黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的活性成分-靶点-信号通路网络

2.6 分子对接验证 将2.5中得到的核心活性成分及核心靶点分别进行分子对接,结果见表2。Autodock软件普遍认为,配受体的结合能≤-5.0 kcal·mol-1表示两者的结合活性较好,若≤-7.0 kcal·mol-1则其结合活性较强[4]。从表2可见,各核心活性成分及核心靶点间结合能力均较好,其中槲皮素与PTGS2、木犀草素与AKT1、山柰酚与RELA 之间具有最强结合力。在Python-Pymol 2.2.0中导入最优对接结果,见图6。

图6 核心基因与“黄芪-太子参-陈皮”角药核心靶点最优值分子对接模型图

表2 “黄芪-太子参-陈皮”角药治疗慢性肾衰竭的核心活性成分与核心靶点分子对接结果

3 讨论

中医并无关于慢性肾衰竭病名的直接记载,但据其临床表现,可归于“癃闭”“关格”“腰痛”“虚劳”等范畴[5]。何学红教授认为,CRF 患者总属先天禀赋不足,脾肾虚损,浊瘀胶着,阻滞脉络,最终发展为五脏皆虚。数据显示,辽宁地区CRF 患者中,脾肾两虚证者为首位[6]。CRF临床表现为水肿、少尿、腰酸痛、面少华、食少纳呆、舌胖大、有齿痕等脾肾虚证之象。李中梓言:“脾具土德,脾安则土为金母,金实水源,且土不侮水,水安其位,故脾安则肾愈安也。”由此可见,肾脏病病机与脾肾相关。关于本病的病因病机,中医古籍多有记载。《素问·至真要大论》言“诸湿肿满,皆属于脾”,脾虚则津液运化失司,水液代谢紊乱,发为水肿。脾虚清气不升、浊气不降,肾虚开阖失固,脾肾两虚,久病致瘀,精微物质失涩外泄,表现为尿有泡沫,称为蛋白尿。CRF患者也可见面色萎黄、贫血之象,《灵枢·决气》言“中焦受气取汁,变化而赤”,脾胃为气血生化之源,CRF 患者多体弱病久,脾虚失于统血,血行滞,溢脉外,表现为面少华、舌紫暗有瘀斑等症状。周身乏力为CRF常见症状之一,可能为低钾血症或贫血等。中医理论认为,人体肌肉壮实与否,与脾胃运化相关,脾旺则血足,身体强壮,反之则四肢无力,甚或大肉尽脱。《四圣心源》言:“肌肉者,脾土之所生也,脾气盛则肌肉丰满而充实。”“脾主肌肉”,“治痿独取阳明”,肾脾为先后天之本,脾之健运依赖于肾阳温煦,肾藏精又依靠脾精滋养,脾肾亏虚,则脏腑失养,肌肉萎缩。综上,何学红教授在CRF的治疗早期从健脾益气补肾的基本治法入手,应用参芪泄浊饮治疗,以黄芪、太子参为君药,配伍陈皮等理气之药,脾肾共治,以达补后天以养先天之效。黄芪补脾益气、利水消肿。研究显示,黄芪可提高血浆白蛋白水平,促进水钠排泄,改善肾脏微循环[7]。太子参是中医临床常用补虚药,具有益气健脾、生津润肺之效,可治疗脾虚体倦、气阴不足等。两药相辅相成,补益肺、脾、肾气机,升清降浊,行血利水。陈皮味苦,辛散温通,行理气化痰和中之功,能有效缓解CRF患者脾胃气滞、呕恶纳呆等胃肠道不适反应[8]。三药相合,共奏益肾健脾之功。

本研究结果显示,“黄芪-太子参-陈皮”角药治疗CRF的活性核心成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚,核心靶点为PTGS2、RELA、AKT1。CRF 的疾病进展与肾间质纤维化密切相关,槲皮素可抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,减少系膜细胞增殖,并抑制细胞外基质的分泌[9]。国内外研究表明,槲皮素具有抗氧化、降低过氧化脂质的作用[10],可通过影响肾小球细胞间黏附分子E-钙粘素的表达,从而保护肾脏细胞免受损伤[11]。实验研究结果证实,槲皮素可增加肾衰竭大鼠肾组织中一氧化氮含量,对肾脏微循环和组织细胞起保护作用[12]。糖尿病肾病及高血压肾病是罹患CRF的重要病因[13],木犀草素可通过抗氧化作用降低肾皮质转化生长因子β1、纤溶酶原激活物抑制物-1的表达,对肾脏起保护作用。山柰酚可降低肾组织中白介素细胞(IL)-1β、IL-6等炎症因子水平,减缓脂多糖诱发的急性肾功能损害发生[14]。研究表明,山柰酚能抑制高糖诱发的肾系膜细胞增殖,保护肾脏功能,延缓纤维化发展[15]。PTGS2 又称环氧化酶2(COX-2),研究显示COX-2与肾小球硬化及肾功能恶化相关,在肾血流动力学和电解质稳态中起至关重要的作用,抑制COX-2的过度表达是防治CRF 的有效途径之一[16]。AKT1在人体各组织中普遍表达,是参与细胞增殖、代谢的关键调节因子,在细胞内的表达对改善肾脏间质纤维化有重要意义[17]。RELA 又名转录因子p65,是构成核因子κB(NF-κB)异二聚体的快反应转录因子之一,参与调节细胞生长分化、免疫、氧化应激等[18],调控氧化低密度脂蛋白诱导的肾小球系膜细胞异常脂代谢,降低肾小球硬化过程的发生率[19]。KEGG 通路富集分析显示,角药治疗CRF 与HIF-1通路有关。HIF-1称低氧诱导因子,在炎性反应中具有重要作用,HIF-1α过度表达会导致促炎细胞因子生成增加,激活肾脏炎性反应和纤维化机制[20]。分子对接结果显示,活性核心成分槲皮素、木犀草素、山柰酚分别与PTGS2、AKT1、RELA结合具有稳定性。

综上所述,本研究立足于名老中医治疗CRF的用药规律及治法经验总结,通过网络药理学探究参芪泄浊饮中健脾益气角药“黄芪-太子参-陈皮”作用于CRF的分子机制,预测得到活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚,可能作用于PTGS2、AKT1、RELA 等多个靶点,通过HIF-1等信号通路,延缓肾间质纤维化。角药各有效成分均可通过调控多种信号通路干预CRF的进展,但由于中药包含的化学成分十分复杂,中药组方配伍具有多变性,药物作用及体内代谢的多方式、多途径,各类中药、疾病信息库的同质性,成分筛选指标的局限性及众多信息通路网络,使分析结果具有不确定性。在证明中医药通过多途径、多靶点、多通路治疗疾病的基础上,后续可反向分析角药中含量较多的多糖、皂苷等如何作用于各类信号通路,其中的调控分子如何相互激活或抑制,为角药发挥补脾益气的作用机制进行补充。同时后续研究还可结合动物实验对其验证补充,探析中药复方各类成分剂量对疾病治疗的影响。