水凝胶与培养基渗透性的研究进展

孙耕天，任金娜 综述，钱明 审校

吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021

近年来，水凝胶在生物医学中的应用越来越广泛，其具有类似组织的机械性能、高吸水性以及良好的生物相容性，因此适用于生物医学。而组织生物工程学的主要目标是模仿细胞外基质再生受损组织，由于水凝胶具有良好的孔隙率和极为亲水的3D结构，在摄取大量的水或液体时溶胀而不溶解，是组织生物工程学中良好的细胞载体或基质。但当细胞以水凝胶为载体进行培养时，水凝胶需与外界培养基进行物质交换，进而保证细胞的活力及生长，行使其相应功能，如药物输送［1-2］、修复受损的神经系统［3］、3D 打印［4］等，而两者的交换方式及影响因素尚不成熟。

本文对影响水凝胶与培养基渗透性的因素及其两者的交换方式作一综述，以期为组织生物工程的发展和研究提供参考。

1 水凝胶的种类

水凝胶是由1 个或多个单体简单反应产生的水膨隆和交联聚合物的三维网络结构，其较强的亲水特性取决于附着在高分子链上的亲水官能团，而对溶解的抵抗能力来自于网络链之间的交联结构［5］。“水凝胶”一词最早由Lee，Kwon 和Park 于1894 年在文章中提出，但最早对水凝胶特性进行系统性描述并开发聚甲基丙烯酸羟乙酯［poly（hydroxyethyl methacrylate），PHEMA］水凝胶是Wichterle 和Lim 于1960年在文献中发表的，主要目的是使其与人体组织产生永久联系，如隐形眼镜的生产［6］。从那时起，水凝胶被广泛应用于药物控制给药系统［7］、生物医学领域作为细胞载体和生物分子［8］、洗涤剂的开发、农业、食品业以及其他领域［9］。水凝胶根据不同的基础分类如下。

1.1 根据来源分类

1.1.1 天然高分子水凝胶 天然高分子水凝胶主要包括：蛋白质类（胶原蛋白、明胶、蚕丝蛋白、纤维蛋白等）和多糖类（壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐、琼脂糖等），其优点是由于与细胞外基质构成相似，具有良好的生物相容性、不刺激炎症和排斥反应，且具有良好的力学性能［10］；缺点为大多数天然聚合物的强度和韧性较差，不能满足相关医学要求［11］。

1.1.2 合成高分子水凝胶 合成高分子水凝胶是指将两种或两种以上的天然聚合物相互络合而形成的水凝胶，包括PHEMA、聚丙烯酰胺（polyacryla-mide，PAM）、聚乙烯醇［poly（vinyl alcohol），PVA］、聚乙二醇（polyethylene，PEG）及其衍生物等各种高分子材料［12］。复合水凝胶将不同聚合物的优点有效组合，相比天然高分子水凝胶，具有高吸水性、良好的生物相容性及生物降解性、有效期长以及凝胶强度有所增加及其他功能［13］。

1.2 根据聚合物的组成分类

1.2.1 均聚水凝胶 由单一单体衍生的聚合物网络结构组成的基本网络单元。其性质由单体的性质和聚合技术所决定［14］。

1.2.2 共聚水凝胶 由两种或两种以上具有至少1种亲水性组分的不同单体所构成，沿聚合物链以随机、块状或交替结构排列［15］。

1.2.3 互穿网络水凝胶 由两种或两种以上聚合物交联合成或天然聚合物组分制成，分子链相互贯穿，至少由1 种聚合物通过化学键的方式交联而形成的网络结构，又称互穿聚合物网络。互穿聚合物网络具有两种形式［13］：①半互穿聚合物网络：一种聚合物网络发生交联，而另一种聚合物与其发生物理结合而形成的网络结构；②全互穿聚合物网络：一种聚合物发生交联后，另一种聚合物与其聚合物网络进行化学交联从而形成的网络结构。

1.3 根据交联类型分类

1.3.1 物理水凝胶 交联过程通过疏水缔合、链聚集、聚合物链络合离子和氢键等物理过程形成的凝胶，其构象的变化具有可逆性。

1.3.2 化学水凝胶 通过化学共价键等交联过程形成的水凝胶，其构象的变化具有永久性和不可逆性。

1.3.3 双网络水凝胶 由物理和化学交联过程形成的水凝胶在静电相互作用下形成的。相对于物理或化学水凝胶的性质而言，双网络水凝胶具有更强的液体吸收能力及对pH 变化更加敏感［16］。传统聚合物水凝胶通常强度弱、机械性能差，其断裂能较低，一般在1 ～10 J／m2的范围内［17］；而一般情况下，双网络水凝胶的断裂能为100 ～1 000 J／m2［18］，因此，双网络水凝胶特有的结构可改善水凝胶的性能。

水凝胶基于在不同基础上分类方法众多，除上述分类方法外，还可根据其结构（即结晶式、非结晶式或半结晶式）、网络电荷的有无（包含中性、离子、两性电解质或两性离子）、外观等进行分类［19］。

2 水凝胶与培养基渗透性的影响因素

细胞培养是组织工程学中最常用且重要的研究方法之一，其技术对实验的研究成果至关重要。水凝胶具有高渗透性的三维网络结构，可用于营养物质的运输和细胞代谢废物的排放，这对维持细胞的生存和功能必不可少［20-24］。水凝胶可为细胞培养与增殖提供适宜且温和的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）环境［25］，而培养基中主要包含各种氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素以及其他辅助物质，为细胞提供营养物质并促进其生长与增殖。因此，水凝胶与培养基的渗透性是决定细胞能否存活与增殖的关键因素之一，而影响其交换方式的因素更为重要。

2.1 水凝胶与培养基中营养物质的扩散类型

ALFREY 等［26］通过培养液的扩散速率和水凝胶中聚合物的松弛速率将扩散分为两大类型：Fickian（CaseⅠ）型和Non-Fickian（CaseⅡ和不规则型）型。当扩散时间为t时，单位面积聚合物所吸收的溶剂量（Mt）为ktn（k 为常数，n 为与扩散机理有关的一个参数，一般在1／2 ～1 之间）。该公式可用来描述任意温度下高分子聚合物体系中的溶剂扩散行为。

2.1.1 Fickian 扩散 在稳态扩散的条件下，单位时间内与扩散方向相垂直的单位面积内的扩散物质流量（扩散通量）与该横截面积处的浓度梯度成正比，即浓度梯度越大，扩散通量越大。Fickian 扩散的特征为在溶胀过程中小分子的扩散速率明显小于高分子结构的松弛速率。因此，水凝胶中溶剂的浓度存在较大的浓度梯度，从聚合物溶胀区到聚合物中心部位溶剂浓度分布呈指数衰减。溶剂的扩散距离与时间的平方根呈正比：Mt=kt1／2。

2.1.2 Non-Fickian 扩散 在非稳态扩散过程中，扩散物质的浓度随时间的变化而发生变化。Non-Fickian 型扩散可分为两种：一种为CaseⅡ型扩散：在溶胀过程中，溶剂的扩散速率大于聚合物网络的松弛速率，扩散的距离与时间成正比，即Mt= kt，但溶剂向高分子聚合物中心扩散时，存在一段呈现Fickian扩散浓度特征的诱导时间［27］；另一种为非常规扩散：在此状态下，溶剂的扩散速率与高分子聚合物的松弛速率在同一个数量级，扩散距离与时间的关系为：Mt=ktn（1／2 ＜n ＜1）。

研究水凝胶与培养基物质扩散的类型对于细胞的培养、药物的传递与释放等功能起着前瞻性和重要的作用。

2.2 影响水凝胶与培养基渗透性的因素

细胞体外培养对外界环境的要求较高，首先要求具备无菌、无毒的培养环境，其次要具有充足的蛋白质、糖类、脂类、维生素、无机离子等营养物质，最后还需具备适宜的pH、温度、渗透压以及合适的氧气和二氧化碳［28］。在此基础上，还需了解影响水凝胶与培养基渗透性的因素，这也是决定细胞能否存活与繁殖的关键因素之一。

2.2.1 Michael 加成型反应 Michael 加成型反应又称1，4 型加成反应，该反应发生在亲核试剂（如胺、硫醇等）和不饱和羰基化合物（如醛、酮等）之间。ELBERT 等［29］是第1批开发并利用Michael 加成型反应制备水凝胶的研究者。其使用多丙烯酸聚乙二醇与聚乙二醇二硫醇交联制备水凝胶，探究运送蛋白质的可能性，结果表明，从凝胶基质中释放蛋白质超过12 d。LUTOLF等［30］观察到，当硫醇基团附着在多肽链上时，凝胶的形成具有不同的动力学。PHELPS等［31］研究了聚乙二醇-4-马来酰亚胺在离体心脏中的原位应用，该水凝胶形成迅速，能够与周围组织很好地黏附，组织渗透率高达50 μm。

因此，Michael 加成型反应对于水凝胶与培养基渗透性具有辅助增强效果。但由于亲核试剂中胺、氰离子、卤离子等带来因环境、温度以及毒性产生的不良影响，硫醇作为主要的优选材料，主要原因是Michael加成型反应是在生理条件下自发进行的［32-33］。

2.2.2 孔隙度 在凝胶过程中，相互连接的多孔网络结构有利于培养基中的溶质、营养物质等更有效地向水凝胶中移动，促进以水凝胶为载体的细胞更快地生长和增殖［34］。孔隙度可通过制备水凝胶前后不同的技术来调节［35］。研究表明，孔隙度较小的水凝胶与培养基的渗透性越好，因为天然组织中的孔隙度是纳米级别的，但具有较大孔隙度的水凝胶对于细胞的生长与增殖需要更长的时间［36-37］。通过研究发现［38］，相比具有更大或更小孔隙度的水凝胶来说，细胞在孔径为0.8 ～8 μm的水凝胶中生长能力增强。YESILYURT 等［39］发现，聚合物网络之间的孔径大小对培养基中蛋白质的流动性会造成影响。PRASOPTHUM 等［40］和DALY 等［41］研究发现，细胞会随着孔隙度的变化而发生变化。当孔径较小时，细胞会出现去分化现象；而在较大孔径的支架中，细胞停止增殖而分泌ECM 成分。因此，支架中孔径的大小在水凝胶与培养基渗透性之间起着重要作用。调节孔隙度最常用的方法之一是改变交联剂的种类以及控制交联剂的量［38］，增加交联剂的量会导致更多交联的产生，从而使支架的孔径变小。而增加孔隙数量的方法有：溶剂浇铸、颗粒浸出、气体发泡以及冷冻干燥等技术，均会留下多孔结构。凝胶过程中支架孔径的大小还决定培养基中蛋白质的释放效应［39］，这对体外细胞培养更为重要。

2.2.3 交联剂的种类与交联方式 交联剂是构成水凝胶三维网络结构的重要组成部分，也是水凝胶制备过程中必不可少的成分。水凝胶从液体状态转化为凝胶状态主要通过物理（疏水缔合、链聚集和氢键）或化学（共价键）交联方法实现［42］。不同交联方式的水凝胶与培养基的渗透性不同，从而导致水凝胶承载的细胞活性不同［43］。因此，聚合物在水凝胶制备过程中交联剂的使用对三维网络结构的形成至关重要。但由于目前的交联剂对细胞活性均有一定影响，近年来学者们尝试不同的交联方法以及优化交联过程，从而促进细胞的活力和生物学性能。LI等［44］以海藻酸钠和丝素蛋白溶液为基础设计了双组分双交联水凝胶，构建了中空管道结构及管壁的微孔结构，为毛细血管的长入提供更多的空间和通道，从而增加了细胞的生物学性能。

2.2.4 其他 除了Michael 加成型反应、孔隙度以及交联剂之外，学者们还研究了其他影响水凝胶与培养基渗透性的因素，如剪切速率等。对于可注射水凝胶，注射器和针头的剪切速率会改变水凝胶的黏度，进而使水凝胶与培养基的通透性发生改变。根据LOPEZ HERNANDEZ 等［45］研究表明，通过对剪切速率的提高，使水凝胶的黏度下降，为培养基的物质与水凝胶进行物质交换提供了相对较低的阻力。

3 小结

综上所述，水凝胶和培养基两者之间的渗透性与Michael 加成型反应、孔隙度以及交联剂的种类及交联方式密切相关。近年来，研究者也从三方面进行了大量研究与实验，并取得了较丰硕的成果。但目前仍存在一些问题：影响水凝胶与培养基两者之间渗透性的重叠因素较多，且细胞活力较为敏感，如何通过控制单一变量研究两者之间渗透性的影响因素是目前面临的巨大挑战，今后应更加关注相关研究。