猪瘟活疫苗耐热保护剂的筛选及安全性评价

周富昌，廖常如，陈韦韦，周琪，周家富，施江，符晓阳

罗益（无锡）生物制药有限公司研发中心，江苏 无锡 214028

猪瘟（classic swine fever，CSF）是一种能导致多系统病变的烈性传染病，一旦发生传染，会给养猪业造成重大经济损失，是世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）重点监测的传染病［1］。CSF 的病原为猪瘟病毒（classic swine fever virus，CSFV），是一种囊膜的单联RNA 病毒，属于黄病毒科瘟病毒属［2-3］。目前，预防CSF 的有效措施仍是接种CSF 活疫苗［4］。目前市售的CSF 疫苗主要有活疫苗（C 株）和亚单位E2 疫苗，活疫苗在价格和市场占有率方面更具有优势［5-6］。

经近20 年的发展，CSF 活疫苗的冻干保护剂从传统的牛奶蔗糖保护剂升级到耐热保护剂，大大延长了CSF 活疫苗在高温条件下的保存期［7］。但不同的耐热保护剂配方对冻干后CSF 活疫苗的耐热效果差异较大［8-10］。为了保持冻干活疫苗抗原的生物活性，添加合适的保护剂来保护抗原的生物活性显得尤为重要［11-12］。本研究采用不同的耐热保护剂配方制备冻干CSF 活疫苗，并对冻干活疫苗进行耐老化试验、稳定性及对仔猪的安全性分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞 CSFV疫苗C株由成都某生物制品有限公司提供；ST（swine testis）细胞（猪睾丸细胞系）购自ATCC。

1.2 仔猪 10头14 ～21日龄仔猪购自成都周边散养农户，经检测CSF 抗体、伪狂犬病病毒抗原及抗体均为阴性。本实验以科研为目的，对仔猪进行养殖和使用，经中国科学院成都生物研究所实验动物伦理委员会批准（批准号：YLSW2021-0012）。

1.3 主要试剂及仪器 新生牛血清（CSF 专用）购自内蒙古金源康生物工程有限公司；鼠抗CSFV 单抗（WH303）和羊抗鼠荧光二抗购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；明胶购自日本Wako 公司；水解酪蛋白、D-山梨醇和海藻糖购自美国Sigma 公司；冻干机（型号：LYO-0.5）购自上海东富龙科技股份有限公司；荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.4 病毒培养 按常规方法在T175 方瓶中培养ST细胞，待细胞长成单层后，弃上清，用无菌PBS 润洗细胞2 次，按0.1 MOI 接种CSFV，加入50 mL DMEM维持液（含2%NBS），于37 ℃，5%CO2条件下培养4 d，收获病毒液上清，共收获3 次，共140 mL。离心去除细胞碎片，分装后-80 ℃保存备用。

1.5 病毒含量测定 采用间接免疫荧光试验。将ST细胞传代至96孔板中，待细胞长至80%，接种不同浓度的CSFV 稀释液，继续培养3 d；用80%丙酮于4 ℃固定1 h；PBS 洗涤3次，加入鼠抗CSFV 单抗（1∶100稀释），200 μL／孔，37 ℃湿盒中作用3 h；PBS 洗涤，加入羊抗鼠荧光二抗（1∶300稀释），50 μL／孔，37 ℃闭光反应1 h；洗涤后利用荧光显微镜观察荧光斑，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.6 冻干CSF 活疫苗的制备及检测 按照不同耐热保护剂配方配制6 批半成品（表1），混匀后分装至西林瓶中，2 mL／瓶，再利用同一冻干曲线进行冻干。冻干后对成品进行外观检查，外观合格的再进行病毒含量测定，计算冻干损失，并根据《中国兽药典》三部（2015 版）的规定，对成品剩余水分、无菌、真空度进行检测。

表1 6批半成品的耐热保护剂配方（%）Tab.1 Heat-resistant protective agent formulation of six batches of semi-finished products（%）

1.7 耐老化试验 随机从外观合格的耐热保护剂配方制备的冻干制剂中分别取疫苗5 瓶，置37 ℃放置10 d，任选3 瓶，分别按《中国兽药典》三部（2015 版）中效力检验病毒含量测定法测定病毒含量。放置前后的病毒含量下降幅度不超过1 个滴度，判定疫苗耐老化试验合格。

1.8 疫苗的安全性评价 选择最佳耐热保护剂配方制备的冻干CSF 活疫苗，分别超剂量（10 和30 头份）接种仔猪各5 头，每支疫苗加入1 mL 无菌生理盐水复溶，经耳下颈部注射仔猪，1 mL／头。接种后观察30 min仔猪临床症状；每日测温1次，共测14 d。

1.9 数据分析 使用Adobe Photoshop 6.0处理图片，SPSS 19.0软件分析数据。

2 结果

2.1 CSFV 的病毒含量 经检测，抗原的病毒含量为106.0TCID50／mL，与耐热保护剂按比例混合后，冻干前样品的病毒含量均为105.88TCID50／mL。

2.2 成品检测

2.2.1 外观检查 20200304、20200305、20020306 批呈白色疏松状，底部有塌陷，外观不合格；20200301、20200302、20200303 批呈白色疏松状，外观合格。见图1。

图1 6种耐热保护剂配方冻干CSF活疫苗的外观Fig.1 Appearance of freeze-dried live CSF vaccine with six heat-resistant protective agent formulations

2.2.2 其他项目检测 外观合格的3 批成品中，除20200301 和20200302 批冻干损失小于20200303 批外，其余各项检测均符合规定，见表2。

表2 3批冻干CSF活疫苗的常规检测结果Tab.2 Routine detection results of three batches of freeze-dried live CSF vaccine

2.3 耐老化试验结果 20200301和20200302批成品的耐老化试验合格，见表3。

表3 冻干CSF活疫苗耐老化试验结果Tab.3 Results of aging resistance test of freeze-dried live CSF vaccine

2.4 疫苗安全性 疫苗免疫后30 min，所有仔猪均未观察到不良临床症状。疫苗免疫后连续测温14 d，10和30头份疫苗接种的仔猪体温均正常，见图2。

图2 冻干CSF活疫苗超剂量免疫仔猪后的体温变化Fig.2 Body temperature curves of piglets immunized with overdose of freeze-dried live CSF vaccine

3 讨论

本研究表明，耐热保护剂中不同海藻糖及水解酪蛋白浓度对CSF 活疫苗的冻干损失及耐热效果具有较大影响，这与海藻糖的玻璃态转化温度相对更高，具有吸水性小，易与蛋白质形成氢键等优点有关［13-16］，因此，在保护剂糖类的选择中，海藻糖优于蔗糖［17-19］，但由于海藻糖的价格远高于蔗糖，限制了其在耐热保护剂中的大量使用［20-22］。

从冻干的6 批成品外观发现，耐热保护剂中的成分对其影响较大，尤其是D-山梨醇和海藻糖的含量。外观合格的3 批疫苗各项检测结果均符合现行《中国兽药典》的要求，冻干损失在0.04 ～0.33 个滴度，水分含量均小于2%。因此，本研究的耐热保护剂中，水解酪蛋白浓度为0.5%时，冻干损失较大。

对冻干外观合格的3 批成品进行耐老化试验，结果表明，水解酪蛋白浓度为1%～2%，D-山梨醇浓度为3%，海藻糖浓度为4%以及明胶浓度为1%时，CSF 活疫苗的耐老化效果较理想，可在37 ℃条件下保存10 d，病毒含量下降滴度不超过1，为CSF 活疫苗的保存及运输提供了便利。对耐老化试验合格的2 批成品进行仔猪超剂量安全性试验，结果显示，10和30头份接种对仔猪安全性良好。

综上所述，本研究筛选的2 个耐热保护剂配方均可用于CSF 活疫苗的冻干，且耐老化效果好，对仔猪安全，可进一步研究该耐热保护剂大规模冻干，为CSF 活疫苗的长期保存提供保障。同时，该耐热保护剂在活病毒种子库的保存方面也具有潜在的应用前景。