细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂应用的研究进展

项婷婷，马淑敏 综述，沃恩康 审校

杭州医学院检验医学院生物工程学院，浙江 杭州 310013

细菌鞭毛位于细菌表面，是细菌中最活跃的运动细胞器，有助于细菌避开有害物质，向营养物质处移动。细菌鞭毛蛋白作为一种病原体相关分子模式，通过Toll 样受体5（Toll like receptor 5，TLR5）和NOD 样受体C4（NOD like receptor C4，NLRC4）两条受体信号通路激活细胞和体液免疫反应，可最大限度提高疫苗抗原的免疫效应。另外，鞭毛蛋白还能与TLR 配体协同作用，用于定制靶向疫苗以满足相关疫苗的要求。鞭毛蛋白佐剂疫苗在预防传染病和抗肿瘤免疫方面具有独特优势，已在多种动物模型和临床试验中得到证实，具有良好的安全性和有效性，有望成为新型疫苗的研发方向。本文主要就细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂应用的研究进展作一综述，以期为鞭毛蛋白佐剂疫苗的研发提供新思路。

1 鞭毛蛋白的结构与功能

细菌鞭毛的主要组成成分为鞭毛蛋白，相同鞭毛蛋白结构单元之间通过非共价键相互连接，呈螺旋状依次组装为鞭毛丝。如伤寒沙门菌的鞭毛蛋白由D0、D1、D2、D3 4 个结构域组成，D0 和D1 结构域将鞭毛蛋白连接成规整的呈细丝状的螺旋茎，形成α 螺旋结构，位于丝状部的内部，且在鞭毛蛋白同源序列中高度保守，主要介导蛋白分子间和结构域间的相互作用，维持整个鞭毛丝空间架构的稳定性；D2和D3 结构域是以D1 结构域为中心向外扩散和延伸，形成β 折叠，位于丝状部的外部，在蛋白质肽链的氨基酸组成、长度和构象上呈高度变化，主要起辅助作用，修饰鞭毛丝表面［1］。明确鞭毛蛋白各结构域的结构特点和作用，可为后续其功能的深入研究提供重要依据。

2 鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的机制及潜力

鞭毛蛋白广泛应用于疫苗佐剂的研发，主要通过激活细胞表面的TLR5 诱导产生炎症介质［2］，启动和调节适应性免疫反应。TLR5信号途径的激活主要通过髓样分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）依赖性和非依赖性途径［3］。MyD88 依赖性途径刺激招募下游适配器分子，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和细胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），随后刺激产生对宿主防御非常重要的多种基因［4］；MyD88非依赖性途径涉及TLR5／TLR4异二聚体复合物的形成，该复合物通过信号分子TRIF 激活途径诱导产生抗病毒细胞因子干扰素β，激活信号转导及转录激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1），促进诱导型一氧化氮合酶基因转录和一氧化氮的生成［5］，干扰素β 是一种重要的信使分子，参与血管、气道平滑肌的调节、神经递质的传递、细胞杀伤、肿瘤细胞溶解及内分泌激素释放的过程，与许多疾病的发生发展密切相关。

除了TLR5 对固有免疫应答和适应性免疫调节的作用外，炎性小体NLRC4 的识别在鞭毛蛋白激活免疫细胞中也起着重要作用［6］。鞭毛蛋白在宿主细胞中的传递首先被NLR蛋白家族中的NAIP5和NAIP6识别；随后，结合磷脂酶的NAIP5／6复合物与NOD样受体NLRC4 相互作用，激活半胱天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinylaspartatespecificproteinase-1，Caspase-1）。Caspase-1将未活化的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）分解为活化IL-1β，形成一种有效的促炎细胞因子，对宿主抗感染及损伤修复具有重要作用。阐明其他识别途径有助于更好地理解鞭毛蛋白与宿主的相互作用［7］，也为基于鞭毛蛋白疫苗的合理设计奠定了基础。

3 鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的应用

鞭毛蛋白可通过多种不同方式与外源抗原结合，提高抗原的免疫效果，增强机体细胞和体液免疫，也可作为黏膜佐剂激发免疫反应，控制黏膜表面的细菌感染。另外，鞭毛蛋白在肿瘤疫苗和肿瘤免疫新疗法的研发方面也取得较好的研究进展［8-9］。

3.1 鞭毛蛋白与疫苗抗原共同作用 鞭毛蛋白是各种外源抗原的有效佐剂，为疫苗开发提供了多种可能性。可溶性鞭毛蛋白与抗原共同免疫时，鞭毛蛋白和TLR5 协调相互作用影响抗体反应，可诱导Th2型细胞免疫反应，刺激巨噬细胞产生浆细胞生长因子，促进浆细胞分化，达到疫苗最佳免疫效果［10］。有研究以蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白为目标进行开发和优化，通过对其融合位点的实验分析，证明抗原-佐剂融合疫苗具有同时将抗原和佐剂递送至组织的优点，并可用于设计其他鞭毛蛋白结合疫苗［11］。另有研究采用分子生物学方法将包含人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）膜近端外区（membrane proximal external region，MPER）的HIV-gp41（gp41607-683）插入基于鞭毛蛋白的载体，以TLR5 依赖的方式显著增强了gp41 膜近端外区的免疫原性，并在小鼠模型中引发适度的MPER 特异性体液反应，表明鞭毛蛋白结构中加入抗原表位后具有明显的优势，且在增强体液免疫反应方面特别有效［12］。因此，TLR配体是疫苗开发中具有较大潜力的候选佐剂。

3.2 鞭毛蛋白与疫苗抗原融合表达 鞭毛蛋白的特殊结构使其能够在不影响构象表位的情况下构建融合蛋白。在流感疫苗研发中，由于流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）头部具有易突变性，使流感病毒结构每年均会发生改变。有研究将流感病毒HA 头部蛋白亚单位与鞭毛蛋白基因连接，构建融合表达质粒，并于原核表达系统中高效表达，制备高免疫效力的重组疫苗［13］。SONG 等［14］将流感病毒HA 抗原的球状头部与鞭毛蛋白C-末端基因构建融合表达质粒，于大肠埃希菌中高效表达，可在小鼠体内表现出较高的免疫原性和有效性。后续研究用H5N1的HA球状头替换了鞭毛蛋白的高变区域，发现删除高变区的鞭毛蛋白融合蛋白不会影响TLR5信号传导，且具有更好的免疫原性［15］。HULEATT 等［16］研究发现，融合蛋白刺激小鼠产生M2e特异性抗体反应的能力优于明矾佐剂，串联M2e 融合鞭毛蛋白的重组蛋白作为流感疫苗候选物具有良好的安全性和机体耐受性，对预防甲型流感有效。

鞭毛蛋白与异源抗原重组融合可增强抗原的免疫原性，刺激病原微生物产生体液和细胞免疫应答［17］。有研究将鼠疫杆菌的两种保护性抗原（F1和V蛋白）融合至鞭毛蛋白的高变区，重组鞭毛蛋白-F1-V 蛋白可被TLR5识别，通过NK-κB途径刺激促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等）的产生，免疫小鼠和非人灵长类动物后，可产生较强的抗F1和抗V体液免疫应答［18］。基于临床前研究结果，研究者对鞭毛蛋白-F1-V 重组融合蛋白在人体中的安全性、免疫原性和耐受性进行评估，进入Ⅰ期临床试验。另有研究表明，融合蛋白可增强过敏原特异性免疫治疗的疗效［19］。将桦树花粉的主要过敏原Betv1 与鞭毛蛋白融合，对其适用性的研究结果显示，该融合蛋白对T细胞具有更强的刺激性和降低IgE 结合的能力［20］。对Betv1 介导的细胞因子分泌代谢机制的研究发现，MAPK介导的NF-κB和雷帕霉素机械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信号的激活是融合蛋白疫苗产生促炎和抗炎症细胞因子的关键途径［21］。有研究表明，细菌鞭毛蛋白与抗体αCD40融合，能与病毒或白血病特异性抗原结合，促进树突状细胞成熟；且该融合蛋白制备的多功能抗体能同时将抗原和佐剂输送至CD40+DCs，诱导肽特异性T细胞反应［22］。

鞭毛蛋白无论是制备为融合蛋白，还是与其他抗原共同作用，均显示出较好的免疫效果［23］。另外，鞭毛蛋白还能通过病毒样颗粒方式进行免疫，保护疫苗抗原，发挥其免疫佐剂效应［24-26］。

3.3 鞭毛蛋白作为黏膜佐剂 黏膜免疫反应是抵御许多细菌和病毒感染的第一道防线［27］，特别是在预防呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道感染等方面［28］。鞭毛蛋白作为一种有效的黏膜佐剂广泛应用于流感、痘病毒病、艰难梭菌病、空肠弧菌肠炎、链球菌感染和恶性疟原虫病等疫苗的研发［29］。研究表明，鞭毛蛋白可引起上皮细胞中NF-κB 的抑制剂快速降解，是一种比脂多糖更有效的上皮细胞激活剂［30］。鞭毛蛋白在黏膜表面固有和适应性免疫反应的激活中发挥重要作用，诱导产生多种炎症介质（包括一氧化氮、IL-6、IL-8 等），对病原体的入侵具有抵御作用。用纯化灭活铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）鞭毛蛋白对PA 肺炎模型小鼠进行鼻内黏膜免疫，结果表明，鞭毛蛋白对肺黏膜固有免疫具有强烈的刺激作用，提高了细菌清除率，降低了肺泡通透性，对气管内PA 诱导的致死性攻击具有显著保护效果［31］。另外，在对新生儿肺移行性树突状细胞成熟和激活的研究中也发现，鞭毛蛋白具有固有性免疫调节作用，在增强肺抗原呈递细胞活性方面具有独特功效，可诱导细胞因子和趋化因子，是早期经鼻黏膜接种疫苗最具希望的靶点［32］。

3.4 鞭毛蛋白作为抗肿瘤疫苗佐剂 鞭毛蛋白以多种方式参与抗肿瘤免疫［33］，已作为一种治疗肿瘤的辅助药物广泛应用于肿瘤疫苗的研发［34-37］。研究发现，光动力疗法与鞭毛蛋白佐剂肿瘤疫苗联合应用治疗恶性黑色素瘤是一种安全可行的组合疗法［35］。通过TLR5 发挥作用的鞭毛蛋白可诱导促炎基因和抗凋亡基因的转录表达，触发先天免疫，增强了抵抗程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）介导的抑制黑色素瘤作用。有研究开发了一种调节肿瘤微环境的纳米刺激剂，是由创伤弧菌鞭毛蛋白B 与载有IR 780 的透明质酸硬脂胺胶束结合而成，通过抑制免疫调节细胞和增加CD103+迁移树突状细胞的比例来调节肿瘤微环境，增强疫苗特性［36］。这种组合策略甚至可应用于老年患者，拓宽了该免疫治疗策略的临床应用范围。

另外，已有研究在动物模型中检测了抗肿瘤剂TLR 激动剂的抗肿瘤活性，且部分研究已进入临床试验［37］。将鞭毛蛋白与刺激伴侣分子Flagrp170 共同免疫，通过其与NLRC4 结合，可成为一种新的免疫药物，增强免疫活性，能够重塑肿瘤免疫表型，并克服耐药性［37］。

4 鞭毛蛋白作为佐剂的优势

传统的免疫佐剂存在多种缺点，受到诸多限制，如部分佐剂在动物模型中的效果有限，且价格昂贵，不利于大规模生产［38-39］。鞭毛蛋白不仅能有效刺激机体产生固有和适应性免疫，还能提高疫苗的稳定性，抵御辐射、化学物质和病原体等各种伤害，避免宿主自身超敏反应［40-41］。HONKO 等［42］研究表明，鞭毛蛋白可促进针对鼠疫杆菌抗原的强烈体液免疫反应，增强抗原提呈细胞对外源抗原的摄取、加工和提呈能力，且可对接种致死剂量鼠疫杆菌的小鼠提供有效保护；该研究还用鞭毛蛋白免疫食蟹猴，未发现局部或全身的炎症反应，免疫小鼠时仅肺部产生微弱的炎症反应。另外，鞭毛蛋白作为免疫佐剂的关键优势是能够诱导产生黏膜IgA保护宿主，这也是防止黏膜表面局部感染的重要因素之一［43］，且较小剂量的鞭毛蛋白仍有效。WEIMER等［44］采用OprF311-341-OprI-鞭毛蛋白免疫灵长类动物，发现当剂量低至1 μg时，也能获得较高的抗OprF-IgG、抗OprI-IgG 和鞭毛蛋白抗体滴度。目前该项研究已进入Ⅰ期临床试验阶段，但结果尚未公布。鉴于上述结论，采用极低剂量的鞭毛蛋白融合蛋白（如1～10 μg）可较大程度避免副作用的发生。

5 小结

近年，许多微生物成分被用作疫苗佐剂，以增强免疫原性较差疫苗的免疫应答，取得了较理想的效果。鞭毛蛋白是一种非常有效的免疫反应刺激剂，也是一种安全的佐剂。鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的使用，除TLR5 和NLRC4 两条机制外，其他涉及哺乳动物的炎症感知和免疫调节受体或途径机制尚未明确。相信随着这些问题的深入研究，鞭毛蛋白作为有效佐剂的应用前景会更加广阔。