鲜冻水产品中生物胺含量及组分检测技术概述

◎ 冯洪燕，栾立宁，杨从发

（1.江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.连云港市质量技术综合检验检测中心，江苏 连云港 222005）

世界粮农组织发布2022 年《世界渔业和水产养殖状况》报告中提到，2020 年全球鱼类产量约为2.14 亿t，鱼类消费占全球人口动物蛋白摄入量的1/6，鱼类的重要饮食价值凸显了发展水产养殖业的重要性。尽管鱼类加工和流通做法不断完善，在上岸与消费之间的损失或浪费仍占上岸水产鲜品的20%左右。鲜冻海水鱼含有丰富的蛋白质等营养成分，为产胺菌和产蛋白酶菌提供了良好的生长环境。蛋白质经产蛋白酶菌分解后产生组氨酸、酪氨酸、赖氨酸和鸟氨酸等小分子物质为生物胺的形成提供了前体物质。凡是体内水分多、含氮物质高、游离氨基酸丰富的水产品都比较容易腐败，并产生生物胺。

生物胺是小分子含氮化合物[1]，是合成核苷酸[2]、蛋白质[3]、生物碱[4]、激素和芳香族化合物[5]的前体物质，在生命活动中发挥着重要的生理作用，普遍存在于鲜冻水产品中，对产品安全质量、口感风味等影响巨大。一些研究表明，摄入过多的生物胺会导致食物中毒，如腹泻和头痛等，摄入总胺1 000 mg·kg-1被认为会对人体健康造成损害。为了保护公众健康，许多国家对生物胺设定定量限。例如，美国食品药物监督管理局将水产品中组胺含量限定为50 mg·kg-1[6]。因为大多数生物胺具有稳定的化学性质和耐热、耐酸性，所以无论感官检查是否检测到腐烂，50 mg·kg-1或更多的组胺含量都表示鱼已经腐烂。欧盟将某些鱼种的组胺可接受水平定为100 mg·kg-1[7]。中国政府将海水鱼（如鳕鱼、金枪鱼、鲱鱼等）的组胺限量定为400 mg·kg-1，其他海水鱼的限量为200 mg·kg-1（GB 2733—2015），鲱鱼罐头产品的限量1 000 mg·kg-1（GB 7098—2015）。根据上海食品药品监管局发布的DB 31/2004—2012，组 胺 限 量 设 定 为100 mg·kg-1。2011 年，欧洲食品安全局、世界卫生组织对发酵食品中组胺进行了风险评估，认为健康成年人组胺的急性参考剂量为50 mg，欧洲食品安全局生物危害小组认为当鱼及其产品中组胺的含量低于200 mg·kg-1时，风险较低。

1 生物胺的检测方法

鲜冻水产品中生物胺测定方法必须具有高分离效率、高选择性和高灵敏度以避免分析物被复杂的基质和结构类似物的干扰。

1.1 高效液相色谱法

1.1.1 采用衍生化工艺的吸收光谱和荧光检测

高效液相色谱使用高压系统将样品加载到装有固定相的色谱柱上，流动相选择可以溶解生物胺的溶剂，根据不同生物胺中组分在两相中分配系数的不同，依次洗脱不同类别的生物胺成分流动到检测器进行检测，从而实现对样品的分离分析。大多数生物胺没有紫外吸收和荧光发射所以需要衍生。生物胺的衍生化技术包括丹磺酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸荧甲酯、乙氧甲基丙二酸二乙酯、邻苯二甲醛和异硫氰酸荧光素。邻苯二甲醛具有灵敏度高、反应快等优点，但其衍生物很不稳定。丹磺酰氯衍生剂，其衍生物稳定性好，检测范围广较为常用。目前常用的检测方法有紫外检测法、荧光检测法、二极管阵列检测法和光电二极管阵列检测法。

CHONG 等[8]用6% 三 氯 乙 酸 匀 浆 和BNZ-Cl衍生化程序制备印度鲭鱼样品进行HPLC 分析以确定生物胺含量。采用液相色谱法研究了环境温度（25 ～29℃）和冰温（0 ℃）等不同贮藏条件与生物胺水平之间的相关性。使用5.0 μm C18色谱柱以乙腈水混合物为流动相在254 nm 波长处进行紫外检测，检测中组胺与组氨酸高度相关（r2=-0.963，p＜0.01），为探究水产品在不同温度的贮存条件下生物胺变化提供了有效检测方法。HU 等[9]对74 个不同的鱼类样品中生物胺的含量进行了测定，建立了HPLC-柱前衍生方法。反应条件为pH=9.5，反应温度60 ℃，反应时间30 min。衍生化后，用反相高效液相色谱系统进行紫外检测，4 ℃和25 ℃贮藏时生物胺组分含量显著升高（p＜0.05）。CHIN-CHEN 等[10]对鱼露中的尸胺、2-苯乙胺、组胺和亚精胺等生物胺进行了定量测定。用DN-BNZ-Cl 衍生化后采用胶束液相色谱进行分离。根据美国食品和药物管理局的要求使用添加的样本验证。此方法的线性范围为0.5 ～500.0 μg·mL-1，检测范围在158 ～375 ng·mL-1，相对标准偏差＜3.2%和精确度在88.6%～103.7%。该方法可应用于鱼露产品中生物胺的常规分析。DONTHUAN 等[11]采用超声辅助分散液-液微萃取与液相色谱联用的方法同时分析发酵鱼的组胺、色胺、尸胺、酪胺和亚精胺。采用FMOC-Cl 衍生化分析物，以便灵敏地使用荧光检测。30 min 内在C18色谱柱和乙腈以及1%乙酸在梯度模式下进行有效的分离和定量。校准范围在0.2 ～300.0 ng·mL-1计算，相关生物胺的定量限为0.02 ～0.50 ng·mL-1，该方法可应用于发酵鱼样品中生物胺的分析，回收率在77.02%～126.38%。TRIKI 等[12]在HPLC 研究中，结合OPA 柱后衍生化以提供荧光检测试验了不同的提取程序来测量鱼粉中样品制备程序的功效。使用不同浓度的三氯乙酸，实验结果表明除酪胺外，使用7.5%和10.0%的三氯乙酸提取生物胺之间没有显著差异，可以看出，这种提取方式对鱼粉中的生物胺是可行的，使用7.5%三氯乙酸一步提取和离心为鱼粉中的生物胺检测提供了一种高效快速的前处理方法。

1.1.2 紫外可见光度法无需衍生的吸收光谱和荧光检测

PAWUL 等[13]建立了一种采用HPLC-DAD 测定组胺的方法。使用C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）和保护柱（10 mm×3 mm，3 μm）在25 ℃下分离；以甲醇和0.1 mol·L-1磷酸二氢钾与1.6 mmol·L-11- 辛 烷 磺 酸（180 ∶820，v∶v）为 流 动 相；以0.5 mL·min-1的 流 速 和 等 度 洗 脱 进 行 分 离； 紫外波长215 nm；进样量20 μL。方法检测范围为3.6 ～420 mg·kg-1，而LOD 和LOQ 分别为1.3 mg·kg-1和1.8 mg·kg-1。PLONKA 等[14]在一项研究中，研究了加工中使用的热处理（干燥、煮沸、冷冻和巴氏杀菌）对生物胺含量的影响。使用带有荧光检测器的RP-HPLC 测定分析物含量。C18色谱柱柱温在25 ℃，流动相为水和乙腈，按照洗脱时间混合两流动相进行梯度洗脱，流速为0.5 mL·min-1。检测限和定量限值分别为85 μg·kg-1（85 μg·L-1）和275 μg·kg-1（275 μg·L-1）。结果表明，每种生物胺都具有热稳定性，蒸煮过程将生物胺含量从18%提高到27%，冻结对生物胺含量影响最小，对生物胺含量影响最大的过程是沸腾，使用的温度最高，处理时间最长。

1.2 液相色谱质谱联用法

液相色谱可以将有机成分从基质中分离出来，而质谱可以获得有机物的相对分子质量、结构和含量信息。质谱学的原理是基于电离，通过质荷比和峰强度来区分生成的离子。离子源使样品带正电荷或负电荷，通常分为ESI 和APCI 两种类型。在ESI 中，带电液滴随着电场中表面电荷密度的增加而蒸发和收缩。重复这个过程，直到离子进入质谱仪。液相色谱质谱联用被广泛应用于强极性、低挥发性混合有机化合物的分析。为了检测的高度精准性，液相色谱质谱联用法已成为分析食品和生物样品中生物胺的重要方法。

ROMERO-GONZALEZ 等[15]采用新型超高效液相色谱-串联质谱联用（UHPLC-MS/MS）法测定了凤尾鱼中腐胺、尸胺、组胺和酪胺的含量。使用正离子模式下的ESI 将所有鱼样品均质在0.6 mol·L-1高氯酸中在经过过滤和提取过程后，使用由甲酸（0.1%）的甲醇水溶液和C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒径）组成的流动相色谱程序。所有生物胺的定量限均低于25 μg·kg-1。PLADIKI 等[16]开发并验证了一种新型、经济有效的方法来测定鱼类组织中主要的生物胺。该方法包括高氯酸提取、吡喃磺酰氯（PSCL）柱前衍生化、甲苯提取、蒸发后在乙腈中反溶、反相高效液相色谱-紫外检测和分子内准分子荧光检测最后用电喷雾电离（ESI）的质谱分析仪对化合物的结构进行分析确定。ZHANG 等[17]采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定了水产品中存在的8 种生物胺，该方法无需使用衍生剂，提取液采用5%的高氯酸溶液，具有较好的线性相关系数（R2＞0.99），较高的灵敏度（几种生物胺的检出限为0.1 ～1.0 mg·kg-1），平均回收率为70.9%～113.1%，相对标准差为0.33%～10.81%，建立了一种快速灵敏的适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中生物胺的检测方法。MOLOGNONI 等[18]发现了一种快速而新颖的LC-MS/MS 方法，用于测定17 种不同肉类和鱼类产品中的生物胺。方法通过SPE从肉类和鱼类产品中提取生物胺（所有提取程序和色谱分离相同），使用与羟基化二氧化硅结合的二异丙基-3-氨丙基硅烷的固定相，在10 min 内实现完全检测分离。线性范围在25 ～200 mg·kg-1。分析生物胺的标准回归方程的相关系数大于0.996。组胺的检测范围最低为25 mg·kg-1。开发的这种方法可以取代其他几种耗时的分析程序，成为实验研究的主要手段。

1.3 生物传感器法

在生物传感器方法中，当分析物进入生物活性物质时会发生生物反应，然后转化为可量化的电信号最后计算出浓度。用生物传感器测定生物胺主要是由于固定在探针上的氨基氧化酶能特异性地催化生物胺脱氨为过氧化氢，通过计算过氧化氢产量可以量化生物胺的含量。此方法分离和检测同时完成，不需要任何其他过程。该方法具有特异性，只对选定的底物反应，不受其他杂质和物理性质的干扰。LERGA 等[19]通过指数富集选择检测组胺的适配体，所选适配体与其他几种生物胺没有表现出交叉反应性，表明该方法对组胺的测定具有专一性。通过这种方法，开发了基于利用氢气和磁珠适配体的竞争测定法来检测尿液中的组胺，检测限达到0.1 mg·kg-1。该学者的另一项研究表明，基于纳米金颗粒适配体法和先前报道的氢气适配体法均适用于金枪鱼和沙丁鱼样品中组胺含量的分析，开发的纳米金（AuNP）适配体法测定的组胺非常灵敏，在食品样品分析和临床分析中检出限均可达到0.5 mg·kg-1。

1.4 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是通过用生物胺免疫动物产生特异性单克隆抗体以检测产品中的生物胺，该方法具有较高的灵敏度。KIM 等[20]为了建立豆瓣酱和苦椒酱中生物胺的快速测定方法开发了一种用于测定组胺的竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法方法，并将其与液相色谱进行了比较。通过竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法测定组胺含量为0.7 ～420.0 mg·kg-1，通过HPLC法测定组胺含量为2.2 ～382.4 mg·kg-1。竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法被认为是定量测定组胺超过10 mg·kg-1水平的可靠方法。此外，竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法测定的组胺含量与样品中7 种主要生物胺的总和呈正相关（R=0.910），这表明竞争性直接酶联免疫吸附剂测定法可作为豆瓣酱和苦椒酱中总胺的快速指标。这种方法快速灵敏，但不能重复使用，复杂的食物基质可能会导致假阳性结果。因此本方法暂时还停留在实验室阶段未能正式投入使用。

1.5 离子交换层析法

离子交换层析法检测生物胺是通过生物胺的阳离子交换能力差异进行分离并检测。RABIE 等[21]使用3 种柠檬酸钠缓冲液（均含有58.8 g·L-1二水合柠檬酸钠、氯化钠、2 g·L-1聚氧乙烯月桂醚、0.5g·L-1苯酚、55.0 mL·L-1甲醇和45 mL·L-1乙醇）逐步梯度洗脱分离生物胺，其中溶剂A（1.5 mol·L-1Na+，pH=6.00）42.5 min，溶剂B（2.0 mol·L-1Na+，pH=5.70）30.0 min，溶 剂C（2.5 mol·L-1Na+，pH=5.45）35.0 min。 用 茚三酮柱后衍生化后，比色检测在570 nm 和440 nm 处进行。该方法对萃取过程中甲基磺酸的浓度和分离条件进行了细致的优化。该分离条件具有良好的分辨率和较高的分离度，在食品样品中的回收率达到82%～103%，检出限达到（23 ～65）μg·kg-1。

1.6 合相色谱法

合相色谱是一种新型的环保色谱分析方法，以二氧化碳和微量有机试剂为流动相，分离效率高，是一种绿色、快速的分离方法。合相色谱法具有运行时间短、溶剂消耗少、峰容量和灵敏度大幅提高等显著优点，这使得它在常规分析中的应用更具吸引力。这项技术可以作为色谱和质谱之外的一种替代或补充方法。考虑到其灵敏度高、重复性好、耗时少等优点，合相色谱法越来越受人们的青睐。GONG 等[22]建立了一种快速合相色谱法在6.5 min 内测定出中国传统发酵食品中的8 种生物胺。用丹磺酰氯预先衍生化生物胺，并在合相色谱法系统上用HSS C18SB 柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）使用CO2和正己烷：异丙醇：氢氧化铵（70 ∶30 ∶0.15，v∶v∶v）的二元系统梯度洗脱，背压为2 000 psi，流速为2.0 mL·min-1，DAD 检测为254 nm。结果显示线性相关系数在0.999 5 ～1.000 0。检测限和定量限分别为21 ～67 ng·L-1和72 ～224 ng·L-1。重复性和重现性的相对标准偏差分别为0.21%～0.87%和1.98%～4.02%。

1.7 毛细管电泳法

毛细管电泳法是在高压电场和毛细管分离的作用下进行的，分离是由于样品中每个组分的不同迁移率和分布特征造成的。JASTRZĘBSKA 等[23]使用等速电泳技术检测了肉类样品中的生物胺提出了两种电解质系统进行分离和测定。回收率达到96%～99%，表明所提出的双电解质系统的精确度达到一个可靠标准。

1.8 薄层色谱法

薄层色谱法是一种快速分离并测定微量物质的检测技术。薄层色谱法因其分离速度快、操作简单、成本低廉、灵敏度高和对设备需求低等优点成为目前应用较为广泛的分离技术之一，现已应用于生物化学、毒理学、药理学、环境科学、食品科学和化学等学科。薄层色谱可用于混合物中组分的分离和定量，它还可以制备分离特定的组分。ROMANO 等[24]建立了一种简单快速的薄层色谱测定方法，用于鱼类和水产品的组胺分析，此方法不需要烦琐的样品预处理。该方法利用咪唑环与对氨基苯磺酸的反应，建立了一种定量比色法定量测定组氨酸的方法。氨基苯甲酸在盐酸溶液中用亚硝酸钠重氮化。然后，重氮化的氨基苯甲酸在弱碱性条件下与咪唑环化合物反应，形成红色偶氮染料。将样品提取物和标准溶液通过氨-乙醇流动相（1 ∶3，v/v）向上展开在薄层色谱板上，组胺在80%乙醇鱼提取物中与其他Pauly 试剂阳性组分成功分离。一次可以在一个板上同时分析5 ～6 个样品，从而降低了溶剂消耗的成本。组胺的检测限为0.02‰，比美国食品和药品管理局设定的0.05‰ 的标准更灵敏。虽然薄层色谱法简单快速，但衍生化技术是关键因素，衍生过程较为复杂，从长远角度看随着设备的更新换代，此方法具有比较优势的前景。

2 结语

本文提及的分析方法对多数生物胺具有良好的灵敏度和较高的选择性，但其中一些方法在实际应用时并不稳定。毛细管电泳法可以处理由于热不稳定而不适合气相色谱的分析物，同时可以提供比液相方法更快速的分离并且仍然保持高分辨度。毛细管电泳法具有分离速度快、操作成本低等优点，通常需要对生物胺进行衍生化才能进行检测，适用于分离环境样品、食品和饮料中的生物胺。生物传感器具有检测迅速、反应灵敏、成本廉价、操作简单和可连续动态监测等优点，但其选择性低难以稳定进行检测，所以需要通过其他方法辅助验证检测结果。至于离子交换层析法检测时质子化生物胺和阳离子交换固定相之间的强疏水相互作用可能会延长保留时间和降低分辨率，这也使得离子交换层析法难以作为检测生物胺的通用技术。由于生物胺衍生后的产物易产生拖尾问题，因此气相色谱不常用于生物胺的测定，日后科研人员对生物胺衍生方法进行改进或能使其稳定而精准地用于气相色谱的检测。高效液相色谱法是目前生物胺定量检测最为广泛使用的方法，其中液相串联质谱法是一种集筛选、鉴定和定量于一体的检测方法，较单纯使用液相色谱省去了复杂且不稳定的衍生化步骤，提高了检测效率和对各种底物的适用性。

尽管过量的生物胺具有毒性作用，但在限定的范围内食用不会引起毒性反应，所以世界各国都缺少生物胺每日摄入量限制，这个限制标准难度就在于同一产品在不同储存条件下的生物胺含量都存在巨大差异，所以建立快捷、精准、稳定、便捷的生物胺检测技术十分必要，这也对保障食品安全和消费者健康非常重要。