霍山石斛多糖的结构分析、生物活性研究进展及与不同种间多糖成分差异性分析

王皓南，范 晶，余坤子，陆静娴，刘军玲，王 莹*，金红宇，马双成*

霍山石斛多糖的结构分析、生物活性研究进展及与不同种间多糖成分差异性分析

王皓南1, 2，范 晶2，余坤子2，陆静娴3，刘军玲4，王 莹2*，金红宇2，马双成2*

1. 中国医学科学院北京协和医学院，北京 100005 2. 中国食品药品检定研究院，北京 100050 3. 浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310053 4. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051

霍山石斛作为一种名贵的滋补类中药，收载于《中国药典》2020年版。多糖为其主要活性成分之一，具有免疫调节、保肝、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等药理活性。通过查阅国内外文献，基于中国知网及PubMed等中英文文献数据库分析当前研究现状及研究热点；总结霍山石斛多糖（polysaccharide，DHP）的提取分离、结构解析及其生物活性；分析其多糖成分与其他常用石斛品种的差异性。以期更好地开发利用DHP，为DHP产品的深入开发与研究及质量标准完善提供参考和思路。

霍山石斛；多糖；可视化分析；结构分析；生物活性；差异分析

霍山石斛C. Z. Tang et S. J. Cheng味甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]。以“一名林兰”始载于《神农本草经》，为中药上品[2]。霍山石斛以其味甘、黏质厚的上乘品质成为石斛中的极品，倍受历代医家推崇，且冠有“中华仙草之最”之称[3]。霍山石斛主产于安徽霍山邻近地区，亦分布于河南境内，是在历代本草中具有明确记载的药用石斛[4]。《中国药典》2015年版石斛项下品种规定为金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎[5]，见图1，《中国药典》2020年版石斛项下[1]新增霍山石斛。

图1 《中国药典》2020年版中收录石斛属药材品种

霍山石斛含有丰富的化学成分，包括有生物碱类、多糖类、酚类、甾体类及挥发油等[6]。其中多糖类成分作为石斛中的重要活性成分，具有免疫调节、保肝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[7-9]。《中国药典》2020年版中多糖是霍山石斛【含量测定】项下的质控指标，标准中采用紫外-可见分光光度法对霍山石斛多糖（polysaccharide，DHP）含量进行测定，要求按干燥品计，不得少于17.0%。霍山石斛中的多糖类成分具有生理活性显著、不良反应小等特点，已有研究对其结构、生物活性等进行研究。本文基于CiteSpace软件对中英文文献数据库中DHP相关文献进行可视化分析，概述当前研究现状及热点。同时，对DHP的提取分离、结构解析及其生物活性进行总结，并将霍山石斛与其他常用石斛品种的多糖成分进行差异性分析，为DHP产品的深入开发与研究提供参考，为其质量标准完善提供思路。

1 基于CiteSpace分析DHP的研究现状

1.1 数据来源及处理

通过中国知网数据库（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）及PubMed等中英文文献数据库中检索与DHP相关的国内外文献。在CNKI以霍山石斛和多糖等为主题词检索中文文献，PubMed中以和polysaccharide为主题词检索英文文献。剔除无关、重复文献，最终纳入文献168条，其中中文文献113篇，英文文献55篇。运用CiteSpace软件进行发文趋势、关键词、机构合作网络等可视化分析，部分知识图谱见图2。

1.2 结果及趋势分析

关于DHP的报道首次见于2003年[10]，2003—2007年研究开始逐步呈递增趋势，2007—2022年发文数量在0～12篇呈现波浪式（图2-A）。对DHP研究的关键词进行分析，有利于掌握该领域各时期的研究热点及未来发展方向。DHP研究的中文文献关键词频次大于等于5次的统计见图2-A，研究主要集中在种源培养、结构分析、生物活性等方面。DHP的英文文献发表较少，依据研究热点关键词分析研究主要集中在生物活性上（图2-B）。从图2-C可知，2005—2010年主要研究霍山石斛的种源培养等对DHP合成的影响；随着国内药理学研究的广泛开展，自2010年起DHP的生物活性研究逐渐活跃，研究热点为肝脏保护、抗衰老、抗氧化、免疫调节、抗炎等生理活性；由于大分子结构复杂、解析难度大，自2014起才逐步开展DHP的结构表征等研究。基于CiteSpace的关键词突现分析，推测DHP的未来研究热点应是深入探索其结构解析、生物活性机制等。

2 提取与分离

2.1 提取

多糖结构复杂，且常与蛋白质、脂质等结合成多糖复合物，同时聚集体的形成不利于多糖的提取分离[11]。中药中多糖成分常见的提取方法包括热水浸提法、微波辅助法等，一般情况下多糖得率被作为评价多糖提取效率的重要指标。霍山石斛作为大宗品种的名贵药材，且多糖含量高，选择适宜的提取方法对其产品开发具有重要意义。但霍山石斛中多糖成分的提取不同于其他中药，有研究表明石斛属药用植物细胞壁结构较密，其主要成分难以用常规方法提取[12]。本研究对目前已报道的DHP的提取方法进行总结，主要分为传统提取技术和新兴提取方法，见表1。

A-2000—2022年DHP研究的中、英文发文情况 B-DHP相关研究热点词网络图（a-中文文献 b-英文文献） C-CNKI中DHP研究的关键词突现分析

2.1.1 传统提取方法 DHP的传统提取方法为热水浸提法，此法因其操作简单，是中药多糖提取最广泛使用的方法。但此法一般适用于提取胞壁外多糖，故采用此法DHP的多糖得率较低[13-18]。此外，有研究采用微波或超声波辅助等方法提取DHP[12,19-20]，上述方法可以结合使用，且提取时间显著缩短，但多糖经超声或微波处理后其糖键可能会发生断裂[25]，是否会因结构发生变化而影响DHP的生物活性，仍有待探讨。

2.1.2 新兴提取技术 中药的细胞壁主要由纤维素构成，石斛多糖与纤维素含量呈反比[26]，推测细胞壁中的纤维素可能是制约DHP最大限度溶出的主要物质。而特异性的降解纤维素破坏细胞壁，可使细胞内多糖最大限度地溶出[21]。采用纤维素酶提取多糖是促进多糖溶出细胞的方法之一，可提高得率且条件温和，但多糖成分亦可能被纤维素酶降解[27]。近年来研究者提出使用半仿生方法提取DHP，利用模拟胃液、肠液，并通过单因素与正交实验得到最佳提取条件[22]。Wang等[23]于2022年提出使用亚临界水提法提取DHP，与传统提取方法相比，该法可更快速、有效地提取多糖成分，得率达到19.52%。同时由于水是唯一的提取溶剂，亚临界水提取法还具有环保和安全的特点[23]。有研究表明温度升高会降低多糖得率和抗氧化性[28]，王升贵等[24]采用超微低温萃取技术提取DHP，得率高达64.04%，该法避免了提取过程中高温处理对多糖含量及活性的影响。总之，在选择DHP提取方法时，需要综合分析实验目的，并结合多糖的结构特征和生物活性，进而选择合适的提取方法。

2.2 分离纯化

在获得粗多糖后，需对其进行分离纯化，去除色素、蛋白质及小分子等杂质，进而获得均一化的多糖成分[27,29]。对DHP的分离纯化方法[8,18,30-44]进行总结，见表2。

2.2.1 脱色 经过前处理获得的粗多糖一般也含有一定的颜色，需要进行脱色。石斛常用的脱色方法有乙醇脱色法、H2O2脱色法、活性炭脱色法及DEAE-纤维素柱色谱法等。通过对4种方法的效果比较发现：DEAE-纤维素柱色谱法脱色效果最佳，多糖损失率较小，且DEAE-纤维素材料可再生使用[18,31]。其他3种方法在对多糖脱色时存在一定的局限性，乙醇脱色法利用相似相溶原理，使有机色素溶解于乙醇中，损失率最大，脱色效果最差[14]；H2O2脱色并不能使色素完全去除，且浓度过高易降解多糖；活性炭脱色存在色素与多糖同时被吸附的现象，从而造成多糖的损失。

2.2.2 脱蛋白 中药粗多糖一般含有一定量的蛋白，常用蛋白去除方法包括：三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法、盐酸等电法、Sevag法及酶解法。前2种方法原理相似，即使蛋白质变性形成沉淀后，离心或滤过去除。此法使用溶液浓度不宜过大，避免造成多糖的损失[18]。有报道针对性的对DHP脱蛋白的方法进行研究，结果表明0.5% TCA脱蛋白效果较好且多糖损失率较低[30]，Sevag法脱蛋白效果优于TCA法[32]，酶法与Sevag法联用在蛋白脱除率及多糖得率上表现优于单种方法[45]。因此可考虑2种方法联合使用进行脱蛋白，以提高DHP中蛋白的脱除率，同时降低多糖损失。此外，亦有采用阴离子交换树脂脱蛋白，此法有机溶剂消耗小、多糖损失率低、环保经济[37]。

2.2.3 去除小分子杂质 在进行多糖的脱蛋白脱色后，仍有小分子杂质的残留，如单糖、低聚糖、无机盐及残留溶剂。DHP中去小分子杂质的研究报道较少，但多糖中通常应选择合适的透析膜进行透析。虽然透析膜具有一定的截留相对分子质量范围，但有些多糖分子是线性的，因此有时相对分子质量较大的多糖分子也可能通过透析袋。

2.2.4 纯化 在脱色、脱蛋白后，要得到均一的多糖成分，还需进一步纯化。现有报道中DHP的纯化多采用柱色谱分离法，即使用离子交换色谱法分离后，再使用凝胶滤过色谱获得纯化多糖。常用的阴离子交换材料包括：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖、DEAE-琼脂糖等，其中DEAE-52纤维素应用最为广泛。凝胶滤过法通常采用Sephadex G、Sephadex S等系列的凝胶柱，也有学者采用琼脂糖CL-6B凝胶柱进行纯化[30-37]。

3 结构分析

多糖结构复杂，包括有4级结构，但现有研究一般从糖含量、单糖组成、相对分子质量、糖连接位置等方面对其结构进行表征，上述结构与多糖活性亦有密切关联[46]。除了经典的多糖分析方法外，近些年亦有研究者提出糖谱法进行多糖的质量分析。本文从基本糖含量、相对分子质量、单糖组成、糖连接位置、糖谱法5个方面对DHP的结构分析研究情况进行总结，见图3。

3.1 多糖的糖含量及蛋白含量测定

DHP糖含量测定的方法为苯酚-硫酸比色法或蒽酮硫酸比色法，此法以葡萄糖为对照品，采用紫外分光光度计进行测定。已有研究表明此法检测的DHP含量为9.90%～46.35%[47-49]，《中国药典》2020年版采用苯酚硫酸法测定霍山石斛中多糖含量，规定其含量不得少于17.0%。此外，Hao等[47]采用衰减全反射红外光谱法（attenuated total reflection near infrared，ATR-NIR）测定DHP的糖含量。作为一种基于光学内反射原理的快速检测技术，ATR-NIR法无损、无标记、绿色、环保，广泛用于中药的分析与表征[50]。与比色法、TMS-GC-MS法相比，ATR-NIR可大大减少分析步骤，降低分析成本[47]。DHP多采用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白测定，Li等[38]采用BCA法对提取的DHPW1中蛋白含量进行分析，得出其蛋白含量为0.15%；田长城[39]使用福林酚法测得DHP1中蛋白含量为0.6%。

表2 霍山石斛的多糖类成分

HPTLC-高效薄层色谱法 PMP-HPLC-前衍生化法-高效液相色谱 GC-MS-气相色谱-质谱联用法 NMR-核磁共振波谱法 HPSEC-MALLS-RID-高效分子排阻色谱-多角度激光散射法 HPGPC-高效凝胶渗透色谱技术 PACE-糖凝胶电泳

3.2 相对分子质量

多糖的相对分子质量对其活性影响较大，一般认为相对分子质量越大其分子体积越大，不利于跨膜进入生物体内；多糖的相对分子量越小则容易与活性位点结合；而相对分子质量过小又不利于形成聚合结构[51]。目前DHP的相对分子量的常用测定方法包括：HPGPC法、HPSEC-MALLS-RID法等，现有研究中DHP的相对分子质量测定结果见表2。从表2可看出，目前通过分离纯化得到的多糖其相对分子质量差异较大，这可能与提取分离方法及采用的相对分子质量检测方法相关。如使用超声波辅助提取法和热水提取法分别提取得到DHP-1A和UDHP-1A，2种多糖均为相对分子质量均一体系，相对分子质量分别为1.17×104和6.08×103[20]。郝杰等[13]使用40%、50%、60%、80%乙醇对霍山石斛总多糖分级沉淀，分别获得4.79×105、3.16×105、3.07×105、8.59×104的多糖。

3.3 单糖组成

单糖作为多糖的重要结构特征，可专属性的反映多糖结构特点，在中药多糖研究中尤为重要[46]。单糖组成的分析方法主要有GC-MS法、PMP-HPLC法、薄层色谱法、高效阴离子交换色谱安培检测法（high performance anion exchange chromatography- pulsed amperometric detecter，HPAEC-PAD）及毛细管电泳法等，DHP的单糖组成目前常用GC-MS和PMP-HPLC等方法进行测定。DHP主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖等组成，还包括葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等成分[34,38-44,51-52]。Pan等[31]对霍山石斛采用石油醚和乙醇依次提取得到粗多糖后，使用DEAE纤维素阴离子交换柱、Sephacryl S-200柱进一步分离纯化得到霍山石斛纯多糖DHPW2，通过GC-MS分析发现主要由葡萄糖、木糖和半乳糖组成，其摩尔比接近1∶1∶0.5。Li等[38]将霍山石斛在50%乙醇中脱水48 h，然后在95%乙醇中脱水48 h，并使用DEAE-52-纤维素柱和凝胶色谱自动纯化系统进一步纯化后得到DHPW1，采用HPAEC-PAD法分析得到单糖组成，甘露糖-葡萄糖-半乳糖37.8∶21.9∶1。刘冰[53]采用水提醇沉和添加α-淀粉酶方法得到霍山石斛粗多糖cDHP，cDHP经纤维素阴离子交换树脂DEAE- cellulose进一步纯化，得到水洗脱的均一组分多糖cDHP-W，采用PMP-HPLC法检测单糖组成得到甘露糖-葡萄糖3∶1。表明不同的提取分离方法所获得的多糖，其单糖组成及物质的量比存在较大差异。

3.4 糖连接位置

多糖的糖连接位置主要采用GC-MS、基质辅助激光解吸飞行时间质谱、1D和2D NMR等技术进行分析和推测。通常使用酸水解分析多糖主链和支链的单糖组成；高碘酸氧化-Smith降解后分析糖单元的键型构成及连接部位分析；甲基化GC-MS用以分析糖单元键型、连接部位及比例确定；NMR法分析碳氢归属及糖连接顺序。研究表明DHP的糖连接位置与药理作用密切相关。Li等[38]发现DHPW1成分的促成骨活性与主链结构(1→4)-linked-β--Glcp直接相关。一种新发现的免疫刺激性多糖DHP-4A，其骨架由(1→6)-Glc、(1→6)-Man和(1→3,6)-Man组成，可有效促进巨噬细胞释放一氧化氮、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-10等[54]。此外，通过修饰DHP结构，亦会对其生物活性产生影响，DHP硫酸化后，其抗糖基化活性显著增强[42]。

3.5 糖谱法

糖谱法[55-56]是指通过系列定位酶切技术联用各种色谱分析，结合多糖活性评价，可实现基于活性结构特征的多糖定性、定量分析，并应用于多种中药多糖及其产品的质量控制[46]。糖谱法的关键步骤在于确定酶的种类，并能通过酶解产生特异性的多糖片段，最终通过色谱法对特异性片段分析实现对不同多糖的鉴别。目前，有研究采用HPSEC- MALLS-RID、GC-MS、NMR和基于PACE、HPTLC多糖分析的糖图谱，对DHP进行定性定量分析[49]。其中，多糖部分酸水解和酶水解产物的PACE指纹图谱与HPTLC指纹图谱相似。

4 生物活性

4.1 免疫调节

DHP具有显著的免疫调节作用，研究表明其对于免疫细胞及肠道黏膜均可产生正向调节作用。王超群等[57]和徐海军等[58]发现DHP具有双向免疫调节作用，改善环磷酰胺诱导的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能降低，缓解卡介苗诱导的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能亢进。同时发现其对腹腔巨噬细胞免疫调节作用的强弱与多糖结构存在密切关联，袁晨琳[44]研究发现DHP中具有各自的结构特征的7种组分多糖（HPS1-A～G），其中，巨噬细胞分泌一氧化氮的影响与多糖1,4-linked-Glcp和1,3,6-linked-Manp含量呈正相关，与1-linked-Galp含量及相对分子质量大小呈负相关；刺激小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的活性与1,4,6-linked-Glcp和1,3,6-linked-Manp的含量呈正相关，而与相对分子质量大小呈负相关。

DHP的免疫调节活性不仅与多糖结构有关，还与给药浓度、温度相关。郝冉等[59]采用溴化氰活化法对DHP进行荧光标记，检测其肠黏膜免疫调节活性，发现DHP 200 μg/mL作用最为显著，为空白对照组的160.5%。DHP的提取量随提取温度的升高而增加，但其肠道黏膜免疫调节活性随提取温度的升高而下降[60]。Xie等[61]对DHP的免疫调节作用机制进行研究（图4），发现DHP可通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）刺激肠上皮细胞，进一步诱导固有层细胞的免疫调节作用。同时，DHP对脾细胞和巨噬细胞中c-干扰素和TNF-α的产生具有明显的刺激作用，促进巨噬细胞分泌一氧化氮和TNF-α，增强巨噬细胞吞噬中性红细胞的能力[35,44,61-63]。此外，DHP具有肠黏膜免疫调节活性，被小肠吸收后分布于肠道固有层内，并可通过Peyer’s结刺激骨髓细胞的增殖[59]。

4.2 保肝作用

DHP具有明显的肝脏保护功能，且保肝作用与其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用密切有关。黄静等[64]和田长城等[65]通过研究DHP对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型保肝作用的影响，发现DHP可显著降低小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平的升高，减轻四氯化碳对肝组织的病理损伤，降低肝匀浆中丙二醛含量，增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性。同时，DHP各剂量组肝组织中TNF-α表达显著降低，炎症反应减轻，肝细胞损伤得到明显改善[64]。其中，DHP可刺激肠黏膜相关免疫系统分泌促进骨髓细胞增殖细胞因子，并且DHP被三氟乙酸全水解为单糖后其免疫活性全部消失，表明DHP是以大分子的形式调节肠道免疫系统[66]。

PI3K/Akt-磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B MAPKs-丝裂原活化蛋白激酶 NF-κB-核因子-κB CINC-1-中性粒细胞趋化因子-1 MCP-1-单核细胞趋化蛋白-1

DHP对肝损伤和肝纤维化有干预作用，可有效减少转化生长因子-β1和肝脏内胶原蛋白表达，阻止肝纤维化的形成，从而维持肝实质细胞膜的正常流动性[67]。此外，DHP可改善酒精诱导的肝组织脂质代谢异常，通过提高SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性、谷胱甘肽的含量及降低丙二醛的水平。从而维持肝组织的抗氧化体系平衡状态，加快酒精及其代谢产物的氧化、水解、排出，减轻并改善代谢产物乙醛对肝细胞的病理损伤[68-69]。在非酒精性脂肪性肝损伤中，DHP对肝组织内总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白等生理生化指标有一定的抑制作用，表明对脂质代谢平衡具有一定调节功效，且具有降低患有心血管类疾病的风险[70]。

4.3 抗炎

中药多糖可通过调控炎性信号通路，活化转录，促进细胞因子的释放，从而发挥其抗炎作用[71-72]。研究表明DHP可抑制巨噬细胞炎性介质的表达和分泌，减轻结肠黏膜损伤，改善类风湿性关节炎，预防溃疡性结肠炎，抑制足肿胀小鼠环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）活性的作用（图5）[73-74]。其作用机制主要通过与巨噬细胞表面的TLR4受体结合，抑制相关信号通路，有效阻断NF-κB和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的DNA结合活性。同时，iNOS、COX-2等的激活受到抑制，和等mRNA表达降低，最终减少一氧化氮、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、TNF-α和IL-1β的释放，从而缓解炎性[43,75-76]。此外，DHP可通过减少特应性皮炎相关的细胞因子，从而较好的改善儿童特应性皮炎症状，并且口服4周后暂无不良影响[77]。此外，DHP通过抗炎作用亦可对动脉粥样硬化发挥具有治疗作用，显著改善高胆固醇饮食诱导的脂质沉积、氧化应激和炎症反应，主要表现为SOD活性显著提高，斑块形成减少，中性粒细胞募集和总胆固醇、三酰甘油、丙二醛和活性氧水平等降低[78]。

4.4 抗氧化与抗衰老

氧化与衰老都与体内自由基和氧化反应相关，当前研究表明DHP具有较好的抗氧化活性（图5）。DHP可显著改善衰老模型大鼠小肠形态结构[79]，并对FeCl2诱导的脂质过氧化反应具有明显的抑制作用，可减轻其肝线粒体氧化损伤，有效提升-半乳糖诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的活力[80-81]。同时，通过抑制衰老相关基因表达，使蛋白表达降低，进而调控细胞周期，降低氧化应激，从而维护细胞内环境与机体组织器官稳态，并发挥抗衰老作用[82-83]。此外，不同相对分子质量的DHP成分均有抗氧化作用，其中组分S1（4.79×105）对H2O2、OH的清除作用强于其他多糖组分[13]。不同提取工艺的DHP抗氧化能力不同，超声波辅助提取的DHP还原力和2,2-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除力比于热水浸提工艺更强[20]。

图5 DHP的抗炎、抗氧化作用

4.5 抗肿瘤

DHP对多种类型的恶性肿瘤细胞有一定的治疗作用，并且具有久服厚肠胃的传统功效。研究表明DHP对胃癌细胞生长有明显的抑制作用，且抑制效果与剂量、时间呈正相关[84]。同时，DHP可抑制胃癌细胞的生长并诱导其凋亡，其抗胃癌活性与有效上调肿瘤凋亡相关基因p53、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein- asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9等表达相关，并且可下调血管生成相关基因和CD34表达与分泌、抑制肿瘤血管生成，增强肿瘤组织T细胞免疫功能[53]。此外，DHP可增加肺泡数量，增厚肺泡壁，抑制肺大疱形成，减少炎症细胞浸润，从而抵抗香烟诱导的肺部炎症，抑制香烟诱导的血清和肺中TNF-α和IL-1β分泌的增强[76]。DHP对CT26-W结肠癌荷瘤小鼠具有显著的抗肿瘤作用，可能在其抑制肿瘤细胞增殖和血管生成、促进肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用[85]。Liu等[8]通过对霍山石斛的茎、根、叶、花中多糖成分的抗胃癌活性进行分析比较，发现霍山石斛不同部位中的多糖成分均表现出抗肿瘤活性。其中，茎多糖（cDHPS）表现出最佳的抗胃癌活性，其抗胃癌活性的差异与其结构特征差异有关。cDHPS结构是由 (→4)-β--Manp-(1→和→4)-β--Glcp-(1→) 组成的-乙酰化多糖，乙酰基连接在(→4)-β--Manp- (1→) 的-3位，与cDHPS相比，其他多糖均为支链多糖。

5 不同品种间及不同生长年限、生长模式下石斛属药材多糖差异性分析

《中国药典》2020年版[1]石斛项下收录的品种包括霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛；此外铁皮石斛在《中国药典》2020年版中作为单独品种收录。多糖作为霍山石斛中的重要活性成分，无论是从质量评价还是产业发展来看，对其不同品种间、生长年限及生长模式下多糖的差异性进行比较研究具有重要意义。

5.1 不同品种间石斛属药材多糖差异性分析

除铁皮石斛多糖（21.8%）外，DHP（34.8%）的含量远高于《中国药典》中其他石斛多糖的含量（金钗石斛：3.53%、鼓槌石斛：5.61%、流苏石斛：2.43%）[86-87]。叶梦娟等[88]对8个品种石斛（霍山石斛、河南石斛、细茎石斛、紫皮石斛、铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛）进行单糖组成分析发现，均由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，含量上存在一定的差异。其中，紫皮石斛中甘露糖占比达到84.35%，而葡萄糖含量仅2.36%，其单糖含量及组成摩尔比明显区别于其他石斛，为鉴别紫皮石斛提供了新思路。此外，有研究对霍山石斛和其他4种药典石斛粗多糖的降血糖活性效果综合分析发现，霍山石斛粗多糖通过胰内外2种作用机制协同干预糖尿病小鼠，降血糖效果最优[89]。DHP表现出较好的抗氧化活性，且显著优于铁皮石斛多糖[90]，在对DHP与铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛3种多糖比较后发现，DHP对四氧嘧啶所致的氧化损伤保护作用最强，且DHP抗氧化能力优于其他石斛多糖[91]。同时，DHP在与其他品种多糖保肝作用比较研究中显示出较好的保肝效果，这可能与多糖含量、相对分子质量、单糖组成和糖苷键连接方式等相关联[92-93]。

5.2 不同生长年限、采收季节的石斛属药材多糖差异性分析

一般认为优质的霍山石斛生长年限较长，同时通过对不同生长年限的霍山石斛进行代谢组学分析，得出最佳收获时间为3年[94-95]，并且3年生的多糖含量优于4年生[96]。在3年的生长期里，总糖含量先下降后增加，这些变化可能与其营养阶段的自身转化和能量代谢有关[93]。Hao等[47]通过对不同采收期的霍山石斛干燥茎多糖进行测定，发现多糖含量存在一定的季节性规律，这可能于不同月份的湿度和光照有关。在5～9月份（夏季）多糖主要表现为高相对分子质量组分，低相对分子质量组分基本消失[47]。有研究对不同生长年限的霍山石斛保肝作用进行研究，发现2年生霍山石斛保肝作用最佳，其多糖含量达到峰值，随后逐渐下降[97]。

5.3 不同生长模式的石斛属药材多糖差异性分析

野生霍山石斛资源稀少，现有资源已不能满足当前市场需求。因此，通过栽培技术可实现霍山石斛的大规模种植，促进产业的可持续发展。在对大棚栽培、林隙地栽培和活树附生3种栽培模式下霍山石斛产量及品质进行比较，发现活树附生栽培下霍山石斛活性成分积累较多，品质更好，为实现高品质栽培霍山石斛提供理论依据[98]。综上，DHP无论是从多糖含量还是生物活性上都显示出一定的优势。

市场流通霍山石斛价格高、商品规格复杂，导致很多其他种属石斛植物混入药材市场，假冒伪劣、以劣充好的问题屡见不鲜。传统的质量控制手段如性状鉴别、薄层色谱鉴别等，难以对霍山石斛药材进行有效的质量控制。因此，提高检测方法专属性、准确性极具意义。多糖作为霍山石斛中的重要活性成分，应作为质量标准控制的重要指标。此处，可运用新思路开发DHP测定方法，如采用生物活性检测法评价其功效活性，进而可全面反映药材质量。

6 结语与展望

霍山石斛作为上品中药，既是中药也是保健食品，富有极高的商业价值[99-100]。多糖作为霍山石斛中主要成分和重要功效成分，对产品开发和质量评价具有重要意义。本文对DHP的研究现状进行总结，认为DHP研究仍存在几个关键问题需要解决突破：（1）多糖结构解析和构效关系的研究仍不够深入，大多只是提取了霍山石斛粗多糖，同时对其单糖组成、相对分子质量进行测定，鲜有研究对其结构进行深入解析。故应加强DHP的化学结构研究，并在一级结构和高级结构层次上开展多糖的构效关系研究，为深入开发DHP产品奠定基础。（2）多糖作用机制研究仍不够深入。尽管已有研究从细胞、动物模型证明其活性，但多糖作用途径还未进行深入探讨。多糖的代谢研究是探索其作用途径的关键部分，然而目前仅采用体外实验考察口服DHP在胃中的代谢情况。多糖在人体内的吸收、分布及代谢是一直以来的研究难点，后期应采用多组学、网络药理学等技术对其进行深入探索。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Progress on structural analysis and bioactivity of polysaccharides ofand analysis of differences in polysaccharide composition between different species

WANG Hao-nan1, 2, FAN Jing2, YU Kun-zi2, LU Jing-xian3, LIU Jun-ling4, WANG Ying2, JIN Hong-yu2, MA Shuang-cheng2

1. Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China 2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China 3. Zhejiang Institute of Food and Drug Inspection, Hangzhou 310053, China 4. Anhui Institute of Food and Drug Inspection, Hefei 230051, China

Huoshan Shihu (), as a valuable tonic Chinese medicine, is included in the 2020 edition of. Polysaccharide is one of its main active ingredients, with pharmacological activities such as immunomodulation, hepatoprotection, antitumor, antioxidantion and anti-inflammation. By reviewing the domestic and overseas literatures, we analyzed the current research status and research hotspots based on Chinese and English literature databases such as China National Knowledge Infrastructure and PubMed. The extraction and isolation ofpolysaccharides (DHP), structural analysis and their biological activities were summarized, and the differences in polysaccharide compositions between commonly usedspecies were analyzed, with view to better developing and utilizing the components of DHP, and providing reference and ideas for the in-depth development and research and the improvement of quality standards of DHP products.

C. Z. Tang et S. J. Cheng; polysaccharides; visualization analysis; structural analysis; biological activity; differential analysis

R284

A

0253 - 2670(2023)15 - 5044 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.029

2023-03-01

国家自然基金青年资助项目（82204617）

王皓南，博士研究生，研究方向为中药质量与安全。E-mail: hanor312@163.com

通信作者：王 莹，博士，副研究员，从事中药质量与安全研究。Tel: (010)53852484 E-mail: wayi_1986@163.com

马双成，博士生导师，研究员，从事中药质量与安全研究。Tel: (010)53852076 E-mail: masc@nifdc.org.cn

[责任编辑 赵慧亮]