基于香气活力值的加拿大烟叶主流烟气关键酸性香气成分分析*

沈梦浩，刘 博，乔跃辉，帖金鑫，郑闪闪，白 冰，杨 靖，倪建彬

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；2.浙江中烟工业有限责任公司 宁波卷烟厂，浙江 宁波 315504)

有机酸在卷烟烟气中有相当重要的作用，其种类及含量与吸食品质有着密切联系[1-2]。由于主流烟气的成分种类复杂且含量较低，为了简化研究对象并能聚焦关键成分，在研究时通常利用多级分离制备技术对烟气成分进行有效分割。张启东等[3]利用凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相色谱(HPLC)逐级分离主流烟气粒相物中的水溶性成分，确定了烟气中烤甜香组分；米冠杰等[4]利用中压和高压两级液相制备色谱对津巴布韦烟叶烟气中酸性成分进行了分离制备；贾春晓等[5]通过优化半制备HPLC 的分离条件，对卷烟烟气的中性香味成分进行了有效分离。

分子感官科学是在成分复杂的体系中寻找关键成分和表征香气风格特征的有效方法[6]，近年来在食品科学领域已有大量研究报道[7]，在烟草科学领域，国内外也先后进行了相关研究，如：利用感官导向分析技术研究了烟叶及烟气中的关键酸味和甜味物质[8-11]；利用香气活力值技术确定主流烟气中关键酸性和碱性物质[12-13]；利用香气活力值研究卷烟主流烟气中的清香、辛香、焦甜香和烟熏香成分[14-17]；通过香气活力值确定福建尤溪烟叶提取物中的重要香气成分[18]；通过对比不同化学成分的香气活力值，确定烟用香精中的关键物质[19]；采用香气活力值对比3 种酸性香料在不同加香方式下的感官贡献度[20]；利用香气活力值对比巨豆三烯酮4 种同分异构体和不同浓度薄荷醇在主流烟气中的贡献度[21-22]。

加拿大烟叶具有明亮度高、香气优雅、劲头适宜等优质特点，对于彰显卷烟醇和淡雅、柔绵细腻的风格特征的贡献非常大，但目前国内对其烟气酸性成分的研究未见报道。本研究基于分子感官科学剖析加拿大烟叶的烟气关键酸性香气成分，以期为原料的开发和替代提供支撑，也为开发具有加拿大烟叶风格特征的烟用香料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

加拿大烟叶由浙江中烟技术中心提供。二氯甲烷购自山东禹王和天下新材料有限公司；浓盐酸和氢氧化钠购自天津市凯通公司；反式-2-己烯酸购自西格玛奥德里奇公司；异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、庚酸、辛酸、壬酸、苯乙酸和肉桂酸购自上海麦克林生化科技有限公司；2,6-二甲基苯酚、苯甲酸和肉豆蔻酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糠酸购自北京百灵威科技有限公司；苯丙酸购自东京化成工业株式会社。

1.2 主要仪器

RM20H 转盘式自动吸烟机(德国Borgwaldtkc 公司)、7890A-5977B 型气相色谱—质谱联用仪(美国Agilent 公司)、Sepacore 中压制备系统(瑞 士Buchi 公司)、MS205DU 型精 密电 子天 平(感量0.000 01 g，瑞士梅特勒—托利多公司产)。

1.3 试验方法

1.3.1 主流烟气酸性特征组分的制备

按GB/T 19609—2004[23]规定的方法抽吸烟支，采用文献[24]的方法获得主流烟气粒相物酸性组分。在转盘式吸烟机上，采用剑桥滤片捕集1 万支加拿大优质烟叶卷烟的主流烟气总粒相物。以异丙醇为萃取剂，采用超声萃取法萃取剑桥滤片上粒相物中的成分，超声萃取30 min，重复3 次，合并得到的异丙醇萃取液，旋干待用。

将上述所得用二氯甲烷溶解，用5% (质量分数)氢氧化钠溶液萃取5 次；合并氢氧化钠溶液，用二氯甲烷洗涤3 次；向氢氧化钠溶液中滴加20% (质量分数)盐酸溶液，调至pH=1，用二氯甲烷萃取5 次，合并二氯甲烷相，即为酸性香气组分。

使用硅胶柱层析技术对上述烟气酸性香气组分进行一级分离，以200～300 目硅胶作为固定相，石油醚∶乙酸乙酯为流动相，依次按100∶1、60∶1、20∶1、1∶1 和0∶1 进行梯度洗脱，各比例洗脱体积为1 200 mL，收集洗脱馏分，记为组分A～E；对各组分进行感官评吸，并以总酸性组分为对照样，确定酸性特征组分。

使用中压制备液相色谱对确定的B 和D 组分进行二级分离，以薄层层析硅胶为填料、石油醚∶乙酸乙酯为流动相，B 组分依次按照80∶1(600 mL)和60∶1 (400 mL)进行梯度洗脱，每200 mL 为1 个馏分，收集馏分，记为组分B1～B5，对各组分进行感官评吸，并以组分B 为对照样，进一步确定酸性特征组分；D 组分依次按照4∶1 (600 mL)和1∶1 (400 mL)进行梯度洗脱，每200 mL 为1 个馏分，收集馏分，记为组分D1～D5，对各组分进行感官评吸，并以组分D 为对照样，进一步确定酸性特征组分。

1.3.2 样品感官评价

空白卷烟为浙江中烟工业有限责任公司提供的未加香加料的单料烟，将分离的组分用无水乙醇稀释为70 mg/mL 的溶液，采用香精注射机注射至空白卷烟中，注射量为每支10 μL，注射后的卷烟置于温度(22±2) ℃、相对湿度(60±5)%的环境下平衡 48 h，待用。由7 位评价人员按照《卷烟 中式卷烟风格感官评价方法》(YC/T 497—2014)[25]对分离的组分进行感官评价，结合GC-MS 分析结果，确定具有加拿大烟叶风格特征的组分。

1.3.3 重要酸性香气成分的确定

根据GC-MS 定性结果并综合香气描述[26-28]，结合已有文献[1-2,4,13,15,18,20,24]确定特征组分中的重要酸性香气成分，使用内标标准曲线法对重要酸性香气成分进行定量分析。

准确称取反式-2-己烯酸80.45 mg，用二氯甲烷定容至100 mL，配成酸性内标标准溶液。分别准确称取异丁酸57.70 mg、丁酸98.31 mg、异戊酸398.60 mg、戊酸137.70 mg、3-甲基戊酸200.80 mg、4-甲基戊酸222.78 mg、庚酸143.00 mg、辛酸194.20 mg、壬酸68.00 mg、苯乙酸1 244.02 mg、肉桂酸465.21 mg、2,6-二甲基苯酚227.14 mg、苯甲酸346.30 mg、肉豆蔻酸29.40 mg、糠酸132.54 mg 和苯丙酸471.36 mg 于容量瓶中并用二氯甲烷定容至100 mL，得到酸性混合标准储备溶液。分别用移液管准确量取0.01、0.05、0.10、0.50、0.70、1.00、3.00、5.00、7.00 和9.00 mL 的标准储备溶液于10 个10 mL的容量瓶中，分别加入1 mL 内标标准溶液，用二氯甲烷定容至刻度，配置成不同质量浓度的混合标准工作液。

选取经1.3.1 节确定的具有加拿大烟叶风格特征的组分100 μL，分别加入内标标准溶液1 mL 并定容至10 mL，采用GC-MS 分析其中的香气成分。GC 分析条件为：DB-WAX (60.00 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱；进样口温度280 ℃；载气为He (≥99.999%)；恒流流速1.0 mL/min；升温程序设置初始温度为40 ℃，保持10 min，以4 ℃/min 升至96 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升至210 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至240 ℃，保持15 min；分流比为10∶1，进样量1.0 μL。MS 分析条件为：传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离方式为电子轰击电离(EI)；电离能量70 eV，溶剂延迟6.0 min；采用全扫描监测，扫描范围为35～500 amu，定量时采用选择离子检测(SIM)扫描，采用NIST 20 谱库检索和标准品对照进行化合物定性。

1.3.4 关键酸性香气成分的确定

根据定量结果和嗅觉阈值数据[29-31]计算重要酸性香气成分中各物质的香气活力值(odor activity value，OAV)，确定关键香气成分。通常认为OAV≥1 的化合物对整体香气的呈现有贡献，且化合物OAV 越大，其对整体香气的贡献度越大[6]。OAV 计算公式为：OAV=香味物质在体系中的含量/香味物质的嗅觉阈值。

2 结果与分析

2.1 烟气酸性特征组分的分离

对一级分离的各组分进行感官评吸，结果表明：对照样具有独特的加拿大卷烟风格特征，浓度大，清甜感较明显；组分A 和组分E 香气变化不明显，且杂气和刺激性增加，对烟气有一定的负面作用；组分B 和组分D 清甜感较明显，余味舒适，烟气较柔和，烟气浓度较大；组分C 香气有所提高，但刺激性大，余味不舒适。综合来看，组分B 和组分D 与对照样评价结果较相似。

采用GC-MS 对组分B 和组分D 进行定性分析，结果(表1)显示：组分B 中共鉴定出32 种成分，主要是挥发性的羧酸，这些化合物在烟气中的作用是增加酸味、突出甜感和提升香气质；组分D 中共鉴定出26 种成分，主要为半挥发脂肪酸、酚类和芳香族酸类，这些化合物在烟气中所带来的甜感及柔和烟气、改善余味的作用与感官评价结果一致。综合感官评吸和GC-MS 分析结果可以确定组分B 和组分D 为体现加拿大卷烟特征的有效组分。

表1 2 个重要组分的定性分析Tab.1 Qualitative analysis of two important groups

对组分B 和组分D 进一步分离后的各二级组分进行感官评吸，结果(表2)显示：组分B1、B2 和B5 对烟气的改善均不明显或有负面作用；组分B3 和B4 均有酸感，与对照样接近，但B4 烟气沉闷，香气风格不突出，而B3 与对照样相似，烟气更加清晰且酸甜感突出；组分D1 和D5 烟气浓度较低，香气不足，对烟气的改善效果不明显；组分D2、D3 和D4 香气质和烟气浓度均有提高，但D4 效果更为明显，香气质及烟气扩散性提升尤为明显，与对照样更加相似。

表2 各二级馏分感官评价Tab.2 Sensory evaluation of secondary fractions

对组分B3 和组分D4 进行GC-MS 分析，结果(表3)显示：组分B3 中共有15 种化合物，主要是碳数在4～9 之间的低级脂肪酸，这类酸在烟支燃烧时可以直接进入烟气，具有焦糖的、甜的和黄油的香韵，可使烟气更具香料烟烟叶的香味风格，和感官评价结果相一致；组分D4 中共鉴定出12 种化合物，主要是芳香族酸，可产生优美的香味和一定的甜味，与烤烟型香味比较协调。综合感官评吸和GC-MS 分析结果可以确定组分B3 和组分D4 为烟气酸性特征组分。

表3 组分B3 和D4 GC-MS 分析结果Tab.3 Analysis results of B3 and D4 components by GC-MS

2.2 重要酸性香气成分的定量分析

确定了16 种对烟气感官质量有积极作用的关键酸性香气成分，其中组分B3 中9 种，组分D4 中7 种(表4)。采用内标标准曲线法建立了16 种待测成分的标准工作曲线，结果(表5)显示：线性范围内相关系数均大于0.999，线性范围较大，可满足检测要求。

表4 16 种重要酸性香气成分香气描述Tab.4 Aroma description of 16 important acidic aroma components

表5 16 种重要酸性香气成分的工作曲线Tab.5 Work curve of 16 important acidic aroma components

2.3 重要酸性香气成分的OAV 及关键成分的确定

由表6 可知：16 种酸性香气成分的OAV 介于2～64 400 之间，均大于1，说明这些酸性物质对烟气风格特征均有贡献。其中，苯乙酸的OAV最高(64 400)，苯甲酸的OAV 最低(2)，最高值和最低值相差5 个数量级，表明不同酸性香气成分对烟叶风格特征的贡献度有很大差异。

表6 显示：组分B3 中，异戊酸的质量浓度最高(1.09 mg/mL)，其次是4-甲基戊酸(0.66 mg/mL)，质量浓度最低的是异丁酸(0.12 mg/mL)，两者之间的差异不大，但阈值最小的异戊酸(0.09 mg/kg)和阈值最大的庚酸(21.23 mg/kg)相差2 个数量级，导致OAV 差异较大。通过OAV 对比可知：虽然异戊酸的含量仅占总含量的31.87%，但它的阈值最小，故异戊酸的OAV 最高(12 111.11)，占总OAV 的77.92%，说明这种物质在彰显烟气风格中有着尤为关键的作用。

表6 还显示：组分D4 中，苯乙酸的质量浓度最高(6.44 mg/mL)，肉豆蔻酸的质量浓度最低(0.07 mg/mL)，两者之间相差2 个数量级，但阈值最大的苯甲酸(340.00 mg/kg)和阈值最小的苯乙酸(0.10 mg/kg)之间相差3 个数量级，因此各成分的OAV 相差较大。苯甲酸的含量占总含量的6.81%，但其阈值最大，故其OAV 最小(2.00)；苯乙酸的含量占总含量的64.46%，且其阈值最小，故其OAV (64400.00)远大于其他化合物，占总OAV 的93.20%，说明其对彰显烟叶风格特征也有着非常重要的贡献。

总体来看，16 种物质中异戊酸和苯乙酸的OAV 远高于其他物质，说明这2 种物质是加拿大卷烟烟气的关键酸性香气成分。低质量浓度异戊酸具有甜的果香、酒香以及奶酪香气，在卷烟中可以起到平和烟气的作用，使烟气具有香料烟的醇和特征；而苯乙酸具有强烈的蜂蜜样甜香，可以明显增加卷烟烟气的清甜感。

3 讨论

卷烟中的挥发性酸和半挥发性酸可直接进入烟气，从而影响卷烟的吃味和香味，因此对烟草及烟草制品中有机酸的相关研究一直备受关注。已有研究主要聚焦于有机酸的成分和含量分析，并发现烤烟中挥发性酸性香气成分含量最高的是甲酸和乙酸，半挥发性酸性香气成分主要是棕榈酸和油酸，虽然通过比较这些数据的差异可以在一定程度上说明香气风格不同的原因，但并未说明究竟是哪些成分对烟叶香气起关键作用，其对卷烟风格特征的贡献程度研究也鲜有报道。可见，仅以香味成分在烟气中的含量衡量其对体系的贡献度，无法在技术层面上全面且准确地判定不同成分之间的差异，对于卷烟烟气而言，香味成分对体系的贡献不仅仅取决于其含量，也与其阈值密切相关，因此需基于OAV 进行综合判定。

范武等[15]利用三点选配法测定了21 种酸香成分在乙醇中的嗅觉阈值，并结合其在卷烟烟气粒相物中的质量分数，计算了14 个品牌卷烟烟气粒相物中各酸香成分的OAV，推测了21 种酸香成分的贡献度，认为异戊酸和乙酸对烤烟型卷烟主流烟气酸香贡献最大；陈芝飞等[12]根据OAV确定了黄金叶品牌卷烟烟气酸性香气成分中贡献最大的是乙酸，异戊酸、戊酸、4-甲基戊酸和癸酸对卷烟香气特征的表达也有重要作用。以上2 项研究的酸性化合物主要集中于脂肪羧酸，忽略了芳香族羧酸的贡献。冒德寿等[8]采用味觉活力值分析技术对51 份烟叶样本主流烟气中的27种有机酸进行了测定，鉴定出烟气中的关键酸味物质为异戊酸、乙酸和戊酸等。尽管该研究的对象包括苯乙酸等芳香族羧酸，但它主要从酸性物质的味觉感受角度研究其对烟气的共献，忽略了酸性物质的香气特质，实际上，由于烟气中的短链脂肪酸含量较低，其对味觉的影响要远小于对嗅觉的影响。

上述研究通过OAV 技术对主流烟气进行直接分析，确定了异戊酸等短链脂肪酸为卷烟的关键酸性组分；而本研究采用柱层析和中压制备技术对主流烟气中的酸性香气成分进行了分离制备，结合感官评价、OAV 及GC-MS 分析结果，确定了彰显加拿大烟叶香气特征的关键成分除了异戊酸等挥发性脂肪族羧酸外，还有苯乙酸等半挥发性芳香族羧酸成分。加拿大烟叶明亮度高、香气优雅、劲头适宜、清甜香突出，具有独特的“浓中透清”的烟气风格，而国内烟叶则是以清(青)香或浓香为主体香韵，加拿大烟叶与国内烟叶烟气酸性香气成分差异可能是其独特风格特征的成因。可见，采用OAV 技术有助于揭示烟叶香气风格形成的内在因素。

4 结论

加拿大烟叶中的关键酸性组分是小分子羧酸和芳香族酸，其中的16 种重要香气成分中，苯乙酸和异戊酸的含量最高；16 种成分对加拿大烟叶的风格特征均有贡献，其中异戊酸和苯乙酸的OAV 远大于其他成分，这2 种物质可以判断为彰显加拿大烟叶风格特征的关键酸性香气成分。