马铃薯块茎淀粉合成相关基因在脱落酸和蔗糖诱导下的表达分析*

李晨晓，艾 菊，杨梅宏，高冬丽

(云南师范大学，云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，云南 昆明 650500)

马铃薯(Solanum tuberosumL.)具有广泛的种植面积和丰富的淀粉资源。淀粉由D-葡萄糖同聚物构成，基于葡聚糖链中是否存在分支结构可将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。块茎是马铃薯淀粉积累的主要器官，叶片合成的蔗糖运输到马铃薯块茎内，在蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy)等多种酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate，G6P)，葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白(glucose-6-phosphate translocator，GPT)转运G6P 进入块茎淀粉体合成淀粉[1]。淀粉前体物质腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG-glucose，ADPG)的形成是淀粉合成的关键步骤，ADPG 主要由腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)催化葡萄糖-1-磷酸(glucose 1-phosphate，G1P)形成。ADPG 经过颗粒结合性淀粉合酶(granule-bound starch synthase Ⅰ，GBSS Ⅰ)的催化形成直链淀粉，通过可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(debranching enzyme，DBE)等酶的相互协同作用催化形成支链淀粉[2]。ATP/ADP 转运蛋白(ATPADP translocator，NTT)也发挥着重要的作用，NTT 将ATP 从细胞质转运到质体，为淀粉合成提供ATP[3]。

淀粉的积累与淀粉合成酶直接相关，而淀粉合成酶基因的表达也与蔗糖和植物激素等因素密切相关。在小麦籽粒中，脱落酸(abscisic acid，ABA)含量与淀粉含量正相关[4]。ABA 也可以影响籽粒中淀粉合成基因的表述，进而影响淀粉的生物合成。ZHU 等[5]研究表明：水稻上位小穗中的ABA 含量高于下位小穗，且上位小穗中淀粉代谢有关基因的表达高于下位小穗。小麦灌浆过程中ABA 调控SuSy2、AGPL1、AGPS1a、GBSS Ⅰ和SBE等关键基因的表达，进而影响直链淀粉和支链淀粉的合成[6]。蔗糖是植物生长的能量来源，同时也是信号分子。蔗糖为淀粉合成提供了碳源，在红薯中外施蔗糖可提高淀粉合成基因的表达，增加淀粉含量[7]。GEIGER 等[8]采用碳14 示踪技术研究了添加碳14-蔗糖或碳14-葡萄糖对马铃薯离体块茎代谢的影响，发现蔗糖可促进离体幼嫩块茎淀粉含量的增加，而葡萄糖可促进呼吸作用。蔗糖和ABA 协同作用对籽粒灌浆和淀粉合成具有重要影响。外施蔗糖和ABA，可提高水稻籽粒的淀粉含量、淀粉合成相关酶活性及其基因表达，同时能够促进籽粒灌浆，增加产量[9]；LI 等[10]研究发现：ABA 或蔗糖单独处理离体玉米胚乳，对其淀粉含量、AGPase 酶活性及基因表达均有促进作用，但其促进程度远低于ABA和蔗糖共同处理。

淀粉的合成不仅需要多种酶参与，而且也受转录因子的调控。在小麦、玉米和水稻等作物中已经报道了多种转录因子调控淀粉的合成[11]。在马铃薯中，淀粉合成基因的功能已被广泛研究，然而淀粉合成基因的转录调控机制尚不清楚。以马铃薯块茎为材料，确定能够促进淀粉合成基因表达的ABA 和蔗糖体系，进而通过转录组测序挖掘差异表达的转录因子，可为解析马铃薯淀粉合成的转录调控机制提供参考。VISSER 等[12]将马铃薯GBSS Ⅰ的启动子连接到β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，GUS)，遗传转化后获得了转基因植株，将阳性植株的离体叶片置于高浓度蔗糖溶液中发现GUS活性明显增强，说明GBSS Ⅰ的表达受蔗糖诱导。以上试验检测的是蔗糖处理下叶片中淀粉合成基因的表达，但适合于马铃薯块茎的ABA 和蔗糖处理体系鲜有报道，淀粉合成基因如何响应ABA 和蔗糖处理也知之甚少。本研究以马铃薯块茎为材料，利用文献报道的3 种体系进行ABA 和蔗糖处理，最终确定能够诱导淀粉合成相关基因表达的处理体系，研究结果可为进一步探索由转录因子介导的ABA 或蔗糖调控马铃薯淀粉合成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将苗龄1 个月的二倍体马铃薯材料CIP151组培苗种植于云南师范大学校园温室内。植株生长约3 个月时，收获直径约0.5 cm 的幼嫩块茎，将其横切为4～5 片备用。

1.2 试验方法

1.2.1 淀粉合成基因的筛选

VAN HARSSELAAR 等[13]对马铃薯淀粉合成基因进行了全基因组分析，并提供了淀粉合成基因的编号。从Spud DB Potato Genomics Resource(http://spuddb.uga.edu/)下载DM 转录组数据，并找到VAN HARSSELAAR 等[13]报道的淀粉合成基因在各组织每千个碱基转录每百万映射读取的碎片值 (fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM)。根据FPKM 值，筛选出在块茎中高表达的基因，用于后续RT-qPCR分析。

1.2.2 ABA 和蔗糖处理

按照文献报道，对马铃薯块茎薄片依次进行不同方式的处理，以便最终筛选出能够促进淀粉合成基因表达的体系。

第1 次处理是按照HUANG 等[14]的报道，略有改动。首先将块茎薄片用10 mmol/L 吗啉乙磺酸溶液(pH 6.5)预处理10～20 min，同时准备以下处理溶液：(1)对照处理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L甘露醇(作为渗透压的对照)；(2)蔗糖处理：1/2 MS 溶 液+200 mmol/L 蔗 糖；(3) ABA处理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L 甘露醇+100 μmol/L ABA；(4)蔗糖+ABA 处理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L 蔗糖+100 μmol/L ABA。将处理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入预处理后的块茎薄片6～9 片，将三角瓶置于摇床(28 ℃，60 r/min)黑暗处理 24 h。每个处理设置3 个重复。

第2 次是根据GEIGER 等[8]的报道。首先将块茎薄片在10 mmol/L 吗啉乙磺酸溶液(pH 6.5)中预处理10～20 min，同时准备以下处理溶液：(1)对照处理：吗啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 甘露醇；(2)蔗糖处理：10 mmol/L 吗啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 蔗糖；(3) ABA 处理：吗啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 甘露醇+100 μmol/L ABA；(4)蔗糖+ABA 处理：10 mmol/L 吗啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 蔗糖+100 μmol/L ABA。将处理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入预处理后的块茎薄片6～9 片，将三角瓶置于摇床(22 ℃，90 r/min)黑暗处理 30 min。每个处理设置3 个重复。

第3 次处理是按照HU 等[15]的报道。准备以下处理溶液：(1)对照：基础溶液(20 mmol/L 氯化钙+20 mmol/L 琥珀酸钠+10 μmol/L 氯霉素，pH 5.0)+200 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L 葡萄糖；(2)蔗糖处理：基础溶液+200 mmol/L 蔗糖；(3) ABA 处理：基础溶液+200 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L 葡萄糖+100 μmol/L ABA；(4)基础溶液+200 mmol/L蔗糖+100 μmol/L ABA。将处理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入预处理后的块茎薄片6～9 片，将三角瓶置于摇床(28 ℃)黑暗静置36 h。每个处理设置3 个重复。

1.2.3 RT-qPCR

为了便于分析ABA 和蔗糖处理的效果，采用RT-qPCR 技术检测基因的表达量。将处理完的块茎薄片用滤纸轻轻拭干水分，提取总RNA，反转录为cDNA；以Actin为内参基因，对12 个基因进行qRT-PCR，各基因的引物序列见表1。qRT-PCR 反应体系为2×TB Green Premix ExTaqTMⅡ 10.0 μL，稀释到1 000 μmol/L 的特异PCR 上、下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，稀释5 倍的cDNA 2.0 μL，加RNase ddH2O至总体积为20.0 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。为建立 PCR 产物的熔解曲线，待扩增反应结束后，按95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s；并从 60 ℃ 缓慢升温到 95 ℃。每个反应3 次生物学重复，3 次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量[16]。

表1 RT-qPCR 所用引物Tab.1 Primers used for RT-qPCR

2 结果与分析

2.1 筛选的块茎淀粉合成基因

根据淀粉合成基因的FPKM 值，筛选出12 个在块茎中高表达的基因(表2)。这些基因的表达丰度有所差异，如SuSy4、GPT2.1、NTT2、APL3、AGPS1.1和GBSS Ⅰ的表达丰度总体上高于SBE3、SS2、SS3、SS5、ISA1.1和ISA2，且这些基因在块茎的表达量均高于在其他组织的表达量。

表2 淀粉合成基因的FPKM 值Tab.2 FPKM value of starch synthesis-related genes

2.2 ABA 和蔗糖处理体系比较

第1 次处理的基因表达检测结果(图1a～c)表明：APL3的表达受ABA 和蔗糖诱导，但GBSS Ⅰ的表达受ABA 和蔗糖的抑制，鉴于该结果与文献报道[12]相矛盾，故对块茎切片进行了第2 次处理。qRT-PCR 结果(图1d～f)表明：第2 次处理对SBE3和GBSS Ⅰ的表达影响较小。第1、2 次处理都未能有效地促进合成基因表达，故对块茎切片进行了第3 次处理。qRT-PCR 结果(图1g～i)表明：第3 次处理对SBE3的表达影响不大，即处理造成的表达不高于对照的2 倍，但提高了GBSS Ⅰ和APL3的表达，尤其是与对照相比，蔗糖处理使APL3的表达提高了约8 倍、使GBSSⅠ的表达提高了约9 倍，说明此次处理能够提高淀粉合成基因的表达。

图1 第1 次(a～c)、第2 次(d～f)和第3 次(g～i)处理的GBSS Ⅰ、SBE3 和APL3 基因表达量Fig.1 Expression levels of GBSS Ⅰ,SBE3 and APL3 under the 1st (a-c),the 2nd (d-f),and the 3rd (g-i) treatment

2.3 ABA 和蔗糖处理下淀粉合成基因的表达

确定第3 次处理为可行的处理体系后，进一步检测了SuSy4、GPT2.1、NTT2、AGPS1.1、SS2、SS3、SS5、ISA1.1和ISA2基因在第3 次处理下的表达情况。结果(图2)表明：与对照相比，ABA处理可诱导SS5、ISA1.1、AGPS1.1、GPT2.1和NTT2基因表达量升高，其中SS5基因的诱导表达量较高，为对照的3.5 倍；蔗糖处理可诱导SS3、SuSy4、ISA1.1、AGPS1.1、GPT2.1和NTT2基因表达量升高，其中GPT2.1基因诱导表达量最高，为对照的38 倍。以上结果说明大部分淀粉合成基因的表达都受ABA 和蔗糖诱导，但诱导表达程度有较大差异。

图2 不同处理下淀粉合成途径相关基因的表达量Fig.2 Expression levels of starch synthesis-related genes under different treatments

3 讨论

本研究发现：第3 次处理使用的溶液和条件能够诱导GBSS Ⅰ和APL3表达；进一步检测SuSy4等9 个基因的表达发现：大部分合成基因都正向响应蔗糖或ABA 处理，这与文献报道[17]一致。CHEN 等[17]研究发现：虽然蔗糖单独处理能诱导玉米胚乳淀粉合成基因的表达，但蔗糖和ABA共同处理能更有效地诱导基因表达。从本研究检测的淀粉合成基因来看，ABA 和蔗糖共同处理诱导了大部分淀粉合成基因的表达，但除SuSy4外，两者共同处理的诱导效果并不优于ABA 或蔗糖单独处理。转录水平的差异性可能是试验所用组织和处理条件不同所致。

马铃薯中报道的可溶性淀粉合成酶包括SS Ⅰ、SS Ⅱ和SS Ⅲ。SS Ⅰ主要在叶片中表达，负责叶片中瞬时淀粉的合成[18]。SS Ⅲ是块茎中主要的可溶性淀粉合成酶，在块茎中沉默SS Ⅲ导致其丧失了80%的活性，从而降低了支链淀粉的合成，并改变了淀粉颗粒的形状[19]。同时沉默SS Ⅱ和SS Ⅲ，其淀粉颗粒形状的缺陷更加明显[19-20]，说明SS Ⅱ和SS Ⅲ在功能上具有冗余性。VAN HARSSELAAR 等[13]对马铃薯淀粉合成基因进行了全基因组分析，找到1 个在块茎中特异表达的SS5，其表达受ABA 和ABA+蔗糖处理的诱导。马铃薯SS5的表达特异性及诱导表达的特点暗示SS5 可能参与淀粉合成，其功能值得深入研究。

淀粉生物合成受到一系列酶的协同调控，淀粉合成相关酶的磷酸化以及复合体的形成等都对淀粉合成具有重要作用[21]。同时，越来越多的证据表明转录调控对淀粉生物合成具有重要作用[11]。HUANG 等[14]对玉米胚乳进行了ABA、蔗糖和ABA+蔗糖处理，对处理后的样品进行转录组测序发现：有57 个转录因子在3 种处理后共同上调或下调，其中的47 个在胚乳中表达较高；对其中的1 个AP2/ERF 家族转录因子ZmEREB156分析发现该蛋白可以结合合成基因的启动子。HU 等[15]对玉米籽粒进行葡萄糖、蔗糖、赤霉素和脱落酸处理，发现只有脱落酸处理能够诱导SS Ⅰ表达；进一步研究发现SS Ⅰ启动子中的CACCG 是响应ABA 诱导的核心结构域，AP2/ERF 家族转录因子ABI4 能够结合CACCG，从而调控淀粉合成。大麦淀粉去分支酶基因ISA1的启动子含有糖响应元件SURE，且ISA1的表达受蔗糖诱导[22]，以甘薯中结合SURE 元件的转录因子同源序列为探针，在大麦胚乳cDNA 文库中筛选出1 个WRKY 家族蛋白SUSIBA2，它能够结合ISA1启动子的SURE 元件，从而调控大麦籽粒淀粉合成。以上研究为阐明ABA 和蔗糖促进淀粉合成提供了理论依据。目前，马铃薯块茎淀粉合成转录因子尚无报道，确定有效的脱落酸和蔗糖诱导体系有利于通过转录组测序挖掘差异表达的转录因子，从而为解析马铃薯淀粉合成的转录调控机制提供参考。

4 结论

本研究确定了第3 次处理使用的溶液(含有氯化钙、琥珀酸钠和氯霉素等试剂)和条件(28 ℃黑暗处理36 h)适用于马铃薯块茎ABA 和蔗糖处理。在该处理体系下，大部分淀粉合成基因的表达都受到ABA 和蔗糖诱导。诱导体系的建立为进一步解析ABA 和蔗糖介导的马铃薯淀粉合成转录调控机制奠定了基础。