一株产吲哚乙酸的日本野漆树内生枯草芽孢杆菌生长条件及其促生特性研究*

卢 宇，马东晓，周锦涛，胡治旭，杨泽慧，段晓盟，纵 丹,2，何承忠,2

(1.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224；2.西南林业大学，云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224)

自然界中的植物和微生物不断地相互作用、相互影响，这些微生物被认为是环境友好的且有利于改善植物的生长[1]。植物生长促生细菌(plant growth promoting bacteria，PGPB)可以存活并定殖于植物根系周围的土壤(根际)中[2-3]，或附着在根、茎、叶上，或作为植物组织内的内生菌，与植物建立互惠关系从而促进植物生长。PGPB 可以增强植物对生物和非生物环境胁迫的抵抗力[4-5]，能够通过对土壤养分的吸收、调整激素水平等不同的机制促进植物生长，或通过激活诱导系统抗性的防御机制来增强植物对病原体的抗性[5-7]。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属(Bacillus)的革兰氏阳性菌，具有好氧兼性厌氧特性，由于在土壤和植物表面普遍存在而被广泛分离，是当前重点研究的益生菌之一[8-9]。国内外学者在枯草芽孢杆菌促进植物生长方面开展了大量研究，一些优势菌株已被应用于促进植物生长的生产实践中[10-11]。研究表明：微生物能产生激素类物质，如生长素、赤霉素和细胞分裂素等，不仅是其自身生长所必需，也能对其生活环境中的其他生物发挥生长调控作用[12-13]。吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是一种重要的植物生长激素，对植物的新陈代谢和生长发育起着重要作用。IAA 产生菌作为重要的微生物资源，可以通过产生促生长的活性物质来影响新陈代谢，刺激植物生长[14]。枯草芽孢杆菌普遍存在于多种植物组织中，能产生IAA[14-15]，研究其对植物生长的促进作用具有重要意义。

日本野漆树(Toxicodendron succedaneum)别称日本木蜡树、日本黄栌，为漆树科(Anacardiaceae)漆树属(Toxicidedron)落叶乔木[16]。日本野漆树籽实产量高、籽粒大，生漆和漆蜡含量高且品质优良，是重要的化工原料，应用前景极为广阔[17]，但有关日本野漆树内生菌的研究非常有限。为此，本研究以日本野漆树无菌苗根中分离到的1 株菌株为材料，明确其种属，探究其生长的最适条件、产生IAA 的能力和促生特性，为后续研究菌株促生机理和开发微生物菌肥提供参考依据和种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

日本野漆树组培苗由课题组前期建立的组织培养技术体系[18]培养所得。菌株分离采用LB 固体培养基(含10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化钠和20 g/L 琼脂)，于121 ℃高压灭菌20 min，存放于锥形瓶中备用[19]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离和纯化

在超净工作台中将1 株长势良好的日本野漆树组培苗的根、茎、叶各取1 g 置于无菌研钵中研磨，加入无菌水10 mL，静置30 min，按10-1～10-5梯度进行稀释，每个梯度吸取稀释液0.1 mL均匀涂布于LB 固体平板上，重复3 次，倒置于28 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。待平板上长出单菌落后，挑取不同形态的细菌单菌落于新的LB 固体平板上划线纯化[20]。

1.2.2 形态学鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[21]进行形态学鉴定。用接种环挑取细菌于载玻片上，滴加无菌水使其充分混匀后于酒精灯火焰上部使其干燥，形成1 层菌膜；冷却后滴加草酸铵结晶紫染液染色1 min，用无菌水冲洗染液，并滴加革兰氏碘液固定1 min；再次冲洗染液；从一侧缓慢滴加95%乙醇进行脱色，直至无色后用无菌水清洗；滴加番红染液复染1 min 后水洗，用滤纸吸干多余水分并于显微镜下观察其颜色及形态特征。

1.2.3 分子生物学鉴定

用Omega 细菌基因组提取试剂盒(Omega Bio-Tek 公司)提取菌株DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否提取成功，从而进行16S rRNA 基因序列扩增。用于菌种鉴定的通用引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[22-23]。扩增反应体系总体积为25.0 μL，包括Super Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，菌株基因组DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 反应条件为：预变性94 ℃3 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，30 个循环，延伸72 ℃ 25 min，4 ℃保存。将扩增产物送至生工生物工程有限公司进行测序，所得序列在NCBI 的GenBank 数据库中进行同源性搜索比对[23-24]；利用MAFFT 软件(version 7)进行序列比对[25]，根据ModelFinder 选择的核苷酸替代模型(TIM3+F+R2)[26-27]，利用IQtree 1.6.7[28]通过1 000 次重复构建系统发育树(最大似然法)。

1.2.4 菌株生长曲线的测定

保存的菌种于LB 固体平板上划线活化，挑取单菌落在LB 液体培养基中于37 ℃、200 r/min 过夜培养；取过夜培养的菌液 0.5 mL 接种到 50 mL LB 液体培养基中，于37 ℃、200 r/min 振荡培养36 h，每2 h 利用分光光度计(TU-1901，普析)测定其在波长600 nm 处的吸光度，以吸光度为纵坐标、时间为横坐标绘制生长曲线[29]。

1.2.5 测定菌株生长的最适温度、pH 值及NaCl质量浓度

在50 mL LB 液体培养基中加入过夜培养的菌液0.5 mL，于200 r/min 条件下培养24 h，分别测定温度(15、20、25、28、30、35、37 和40 ℃)、pH 值(3、4、5、6、7、8、9、10 和11)及NaCl质量浓度(0、10、20、30、40 和50 g/L)对细菌生长的影响。细菌生物量的测定方法为：用分光光度计测定波长600 nm 处的吸光度，根据吸光度值判断其生长状态，每个试验重复3 次[29-30]。

1.2.6 菌株产IAA 能力的测定

采用Salkowski 比色法测定菌株产IAA 的能力[31]。将纯化的菌株置于LB 液体培养基过夜培养并制成发酵液，取0.5 mL 接种于含3 mmol/L 色氨酸的50 mL LB 培养基中，于35 ℃、200 r/min 摇床培养48 h。取发酵液1 mL 于4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液300 μL 于2 mL 离心管中，加入Salkowski 显色剂300 μL 进行显色反应。以60 mg/L IAA 标准溶液300 μL 为阳性对照，以不加菌液的LB 培养基为阴性对照。室温避光静置30 min，观察颜色变化。取菌株发酵液2 mL 于 10 000 r/min 离心 5 min，取上清液500 μL，等体积加入Salkowski 显色剂，置于室温避光环境下反应30 min，测定其OD535值，根据标准曲线计算单位体积发酵液中产生的IAA 含量。

1.2.7 菌株发酵液浸种对种子萌发的影响

分别选取籽粒饱满的水稻、云南松和思茅松种子，于25 ℃条件下用无菌水浸种催芽24 h；再用0.5% KMnO4对种子进行表面消毒[32-33]，无菌水冲洗3～5 次后备用。将在35 ℃、200 r/min条件下培养48 h 的发酵液用无菌水配制为1.0×108CFU/mL 的重悬液(OD600=0.8)，并依次稀释为1.0×107和1.0×106CFU/mL 的重悬液备用。分别用50 mL 上述重悬液浸泡种子，以50 mL 无菌水浸泡作为空白对照(CK)。浸种30 min 后将种子转移至含湿润滤纸的培养皿中，每个处理30粒种子，设置3 个重复，每天观察发芽情况，记录发芽率和发芽势，以种子露白作为发芽标准[34]。

1.2.8 菌株发酵液喷施对水稻幼苗生长的影响

选取已经发芽的水稻种子接种于方形培养皿中，每皿接种20 粒种子。用上述3 种密度(1.0×108、1.0×107、1.0×106CFU/mL)的重悬液喷施种子，以无菌水作为空白对照(CK)。每皿喷施液体1 mL，每个密度设置3 次重复。于(26 ±2) ℃下培养，7 d 后测量水稻株高、根长、茎粗和生根数。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2016、SPSS 25 和Graphpad 8.2 进行数据统计、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株形态学分析

在日本野漆树组培苗根中分离纯化得到1 株菌株，将其编号为BSH-1。将菌株BSH-1 接种于LB 固体平板上，其单菌落形态呈圆形，表面湿润且光滑，颜色为橘红色；在显微镜下观察到菌株革兰氏染色后呈紫红色，且细菌形状为短杆状，可以初步判定其为杆状革兰氏阳性菌(图1)。

图1 菌株BSH-1 形态学鉴定结果Fig.1 Morphological identification results of strain BSH-1

2.2 菌株BSH-1 的分子生物学鉴定

由图2 可知：菌株BSH-1 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有密切的亲缘关系，结合细菌形态学特征分析结果以及对16S rRNA 基因的分子生物学分析，初步判定菌株BSH-1 属于枯草芽孢杆菌。

图2 基于菌株BSH-1 16S rRNA 基因序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of strain BSH-1

2.3 菌株BSH-1 的生长曲线分析

由图3a 可知：接种菌株BSH-1 后，延迟期为0～2 h，此时菌株生长缓慢；对数生长期为2～16 h，此时菌体数量明显增多，其中培养到11 h时生长速率达到最大；稳定期为16～28 h，菌体数量不再增加，28 h 菌体的OD600值达到最大，为2.278；28 h 后进入衰亡期，菌体数量下降。可见，菌株BSH-1 的最适培养时间为16～28 h。

图3 菌株BSH-1 的生长特性Fig.3 Growth characteristics of strain BSH-1

2.4 温度、pH 及NaCl 质量浓度对菌株BSH-1生长的影响

由图3b 可知：菌株BSH-1 在15～40 ℃均可生长，其中，菌株在15～35 ℃条件下的生长速率随着温度的升高而加快，35 ℃时生长量达到最大，35 ℃后生长速率减缓。由图3c 可知：当pH 值小于5 或大于10 时，菌株几乎不生长；当pH 值在5～7 时，菌株生长速率逐渐加快，pH 值为7 时菌株生长量达到最大，pH 大于7 时菌株生长速率呈下降趋势。由图3d 可知：NaCl 质量浓度为10 g/L 时，菌株BSH-1 的生长量最大。可见，菌株BSH-1 生长的最适温度为35 ℃，最适pH 值为7，最适NaCl 质量浓度为10 g/L。

2.5 BSH-1 产IAA 能力的鉴定

Salkowski 比色试验确定BSH-1 菌株的代谢过程可产生IAA；以吸光值OD535为纵坐标(y)、IAA质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线(图4)，得到线性回归方程y=0.012 4x+0.118 7，R2=0.995 1。根据标准曲线测定菌株BSH-1 产IAA 的能力可知：菌株发酵液中IAA 的含量为17.27 mg/L。

图4 菌株产IAA 能力的检测Fig.4 Detection of IAA producing ability of strain

2.6 BSH-1 发酵液浸种对种子萌发的影响

由表1 可知：水稻、云南松和思茅松种子在不同密度的BSH-1 发酵液浸泡下，其发芽率和发芽势均无显著差异，说明发酵液浸种对3 种植物种子萌发无显著促进作用。

表1 不同密度BSH-1 发酵液浸种对3 种种子萌发的影响Tab.1 Effects of seed soaking with different densities of BSH-1 fermentation broth on the germination of three kinds of seeds

2.7 BSH-1 发酵液喷施对水稻幼苗生长的影响

由图5 可知：与对照组相比，喷施菌株BSH-1发酵液后水稻幼苗的株高和生根数显著增加，且当喷施1.0×106CFU/mL 发酵液时促进作用最显著，分别提高9.0%和20.8%；当喷施1.0×107和1.0×106CFU/mL 发酵液时，水稻幼苗茎粗较对照组显著增加；喷施发酵液对水稻幼苗的根长无显著影响。可见，喷施菌株BSH-1 发酵液对水稻幼苗有较显著的促生效果，且对水稻幼苗生根的促进作用更明显。

图5 喷施菌株BSH-1 发酵液对水稻幼苗生长的影响Fig.5 Effect of spraying fermentation broth of strain BSH-1 on the growth of rice seedlings

3 讨论

植物体内普遍存在内生菌，彼此间不断相互作用、相互适应[35]。植物为内生菌提供生存环境，内生菌通过代谢刺激和促进植物生长[36]。内生菌由德国科学家DE BARY 于1866 年首次提出[37]，随着研究领域不断拓宽和研究方法的不断优化，植物与内生菌互作的重要性逐渐被揭示，对其研究也成为当前的热点之一。在植物生长发育过程中，植物激素吲哚乙酸(IAA)有着重要的促进作用。枯草芽孢杆菌作为PGPR 占比最多的一类内生菌，其具备的产IAA 能力能显著促进植物生长发育。已有研究在甘蔗[9]、水稻[20]、地黄[38]和烤烟[39]等作物中分离到具有产生IAA 能力且对植物生长有促进作用的枯草芽孢杆菌。桂楚伊[40]在番茄中分离鉴定得到1 株枯草芽孢杆菌B21，其IAA 产量达到9.3 mg/L，并且能够促进小麦的生长。刘晓瑞[41]从水稻中分离鉴定得到1 株芽孢杆菌属内生菌A48，其IAA 产量达到41.55 mg/L。赵柏霞[42]对甜樱桃中的阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai) B20 进行产生IAA 的条件优化，提高了IAA 的产量。本研究从日本野漆树组培苗根系中分离得到枯草芽孢杆菌BSH-1，其IAA 产量达17.27 mg/L，且对水稻苗高、茎粗和生根数具有显著的促进作用。下一步将对菌株BSH-1 的装液量、碳源和氮源等最适培养条件进行优化，从而探究其产生IAA 的最适条件。鉴于菌株BSH-1 的促生特性，筛选出最适菌株发酵液密度也是非常必要的。此外，随着分离菌株数量的增加，也为探讨BSH-1 与其他有促生效果的菌株混合使用对植物生长的促进效果提供了可能。

枯草芽孢杆菌普遍存在于植物界，其对植物的促生和保护作用为深入研究植物与微生物互相作用的分子调控机制提供了有利依据[43]。此外，枯草芽孢杆菌具有较好的抗逆性和促生特性，能够为开发绿色、环保、高效的微生物肥料提供资源[44]，在一定程度上为中国农业和林业的发展提供帮助。

4 结论

本研究从日本野漆树组培苗根系中分离得到1 株菌株，并将其鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。该菌株在35 ℃、pH 值为7 以及10 g/L NaCl条件下生长最旺盛。该菌具备产生IAA 的能力，可通过促进株高、茎粗和生根数促进水稻苗生长。研究结果为该菌株微生物肥料的开发和利用提供了理论依据。