HPLC法同时测定保健食品中9种降糖药物的含量

于文萃

近年来，随着人们养生保健观念的逐渐加强，一些宣称可以辅助调节血糖的保健食品越来越受到老年人尤其是老年糖尿病患者的青睐，据文献[1-3]报道，有商家在产品中非法添加化学降糖药以达到令患者满意的降糖效果，导致患者放弃了药物治疗，长期服用该类产品将严重威胁糖尿病患者的健康。检出非法掺入化学降糖药最权威的方法是高效液相色谱-质谱联用[4-5]技术，但该方法设备费用昂贵，一定程度上限制了在基层检验单位的使用。本研究为了使基层检验单位也可以及时准确地筛查保健食品的药物添加问题，更快、更简便地确定降糖类保健食品中是否掺入了化学降糖药物的成分，节约检测时间和成本，建立了使用高效液相色谱-紫外检测器法同时检测9种化学降糖药物含量的方法，检测品种涵盖了目前上市的磺酰脲类、非磺酰脲类、噻唑脘二酮类等主要降糖类化学药物，该方法准确，简便，可操作性强，适用于降糖类保健食品非法添加降糖药物成分的筛查。现报告如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究立项时间为2022年初，于2022年底完成。研究重点是对我市在售降糖类保健食品中是否添加降糖药物进行筛查，以保障我市人民群众的用药安全。本研究所用样品均为我市各保健食品销售商店在售的宣称具有降糖类保健功能的19个厂家生产的19个批次保健产品。

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱系统，岛津SPD-20A（UV-Vis Detector），岛津Labsolution色谱工作站。

1.2.2 试药 对照品：格列本脲（批号：100135-201806），格列齐特（批号：100269-201505），格列喹酮（批号：100280-201403），格列吡嗪（批号：100281-201604），格列美脲（批号：100674-201904），那格列奈（批号：100619-201702），瑞格列奈（批号：100753-201303），盐酸吡格列酮（批号：100634-202104），盐酸罗格列酮（批号：100673-201902）以上均由中国药品生物制品检定研究院提供。取供试品为辅助降糖类保健食品19批（均为市售），水为纯化水，乙腈为色谱纯，冰醋酸、乙酸铵为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取格列本脲对照品10.81 mg，格列齐特对照品10.12 mg，格列喹酮对照品10.89 mg，格列吡嗪对照品10.34 mg，格列美脲对照品10.34 mg，那格列奈对照品10.72 mg，瑞格列奈对照品10.47 mg，盐酸吡格列酮对照品10.21 mg，盐酸罗格列酮对照品10.98 mg，分别置于10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取格列本脲，格列齐特，格列喹酮，格列吡嗪，格列美脲，那格列奈，瑞格列奈，盐酸吡格列酮，盐酸罗格列酮对照品溶液各5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取供试品约1.5 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超声提取30 min（功率125 W，频率53 kHz），滤过，残渣用少量甲醇洗涤3次，合并滤液于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，即得。

1.3.3 色谱条件及系统适用性实验 迪马Diamonsil C18色谱柱；以0.1%冰醋酸-0.01 mol/L乙酸铵水溶液-乙腈（53：47）为流动相；柱温为35 ℃；进样量10 μL；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为210 nm。混合对照品色谱图（见图1）。在该色谱条件下，理论塔板数分别按格列吡嗪、那格列奈、盐酸罗格列酮、盐酸吡格列酮、格列齐特、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈峰计算均不低于10000，分离度均符合《中国药典》2020年版要求。

图1 混合对照品HPLC色谱图

1.4 方法学考察

1.4.1 线性范围 精密量取1.3.1项下的混合对照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、40 μL分别注入液相色谱仪，按照1.3.3项下的色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，绘制标准工作曲线，经回归分析，格列吡嗪质量浓度在22.68～413.60 μg·mL-1，那格列奈在21.44～428.80 μg·mL-1，盐酸罗格列酮在21.96～439.20 μg·mL-1，盐酸吡格列酮在20.42～408.40 μg·mL-1，格列齐特在20.24～404.80 μg·mL-1，格列本脲在21.62～432.40 μg·mL-1，格列美脲在20.68～413.60 μg·mL-1，格列喹酮在21.78～435.60 μg·mL-1，瑞格列奈在20.94～ 418.80 μg·mL-1范围内有良好的线性关系，r≥0.9998，回归方程见表1。

表1 9种降糖药物的回归方程与线性范围（n=5）

1.4.2 精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按照1.3.3项下色谱条件，重复进样6次，记录色谱图，9种降糖药物各自峰面积的RSD值范围为0.3%～0.8%（n=6）。

1.4.3 稳定性实验 按1.3.1项下的方法制备混合对照品溶液，按照1.3.3项下色谱条件，分别于0，2，4，8，12，16和24 h进行测定，记录色谱图，9种降糖药物各自峰面积的RSD值范围为0.5%～0.7%（n=7）。

1.4.4 检出限和定量限 精密量取1.3.1项下混合对照品溶液，使用微量取样器精确稀释制备不同浓度的系列溶液，分别注入液相色谱，按照1.3.3项下的色谱条件测定，记录色谱图，按信噪比（S/N）为3时，确定检出限，信噪比（S/N）为10时，确定定量限，检出限和定量限结果见表2。9种降糖药物的检出限浓度范围为0.03～0.4 μg·mL-1，定量限浓度范围为0.1～1.1 μg·mL-1。

表2 9种降糖药物的检出限和定量限结果

1.4.5 回收率试验 在空白降糖保健食品供试品溶液中精确加入降糖药物对照品溶液，配成低、中、高3个浓度的加样标准品样品，考察9种降糖药物成分在降糖保健食品中的回收率。结果见表3。

表3 9种降糖药物的回收率结果（n=6）

2 结 果

取供试品为19个生产厂家共计19个批次的辅助降糖类保健食品，按1.3.2的方法制备供试品溶液，按照1.3.3项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，以外标法按峰面积计算含量。与对照品检测结果对照，结果显示19个批次的供试品，均未检出磺酰脲类、非磺酰脲类、噻唑脘二酮类等9种降糖药物的非法添加，证明检测方法有效。

3 讨 论

辅助降糖类保健食品是具有保健功能或者以补充营养物质为目的的食品，适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且是对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害的食品，正因为保健食品被定义为食品的一个种类，所以在人们的印象中保健食品会比药品安全，但目前市场上在售降糖类保健食品中个别存在添加降糖药物的现象，对老年朋友或者糖尿病患者来说，服用这种添加降糖药物的保健食品会比直接服用降糖药物后果严重，因为降糖药物会明确指明适用人群、服用剂量、不良反应以及注意事项等等[6-7]，而添加降糖药物的保健食品则属于违法行为，其没有明确地标出添加的是何种药物以及添加的剂量，长期服用会产生严重的后果甚至危及生命，因此有必要进行添加剂检测并需要研究保健食品中非法添加药品的筛查方法[8]，为市场监管部门监管保健食品中的非法添加行为提供技术支持，为人民群众追求健康的需求提供安全保障。

高效液相色谱-质谱（液质）联用技术是采用质谱作为定性定量分析的检测器，利用分离物质的分子量进行定性分析，由于质谱仪器价格昂贵，维护保养成本也高，一般的基层检验单位不具备这种仪器，采用反相高效液相色谱法，利用已知降糖药物的对照品进行外标法定性定量分析也可以达到液质联用检测的效果，而且该方法设备简便，维护保养费用较低，基层的检验单位普遍配备，所以建立高效液相色谱-紫外检测器的分离分析方法有助于基层检验单位对相关保健食品进行及时准确的筛查。

本文将临床常用的磺酰脲类、非磺酰脲类、噻唑脘二酮类等9种降糖药物采用高效液相色谱的方法同时进行分离，分离度符合相关要求且峰型良好。同时我们也考察了不同品牌的色谱柱，分离重现性良好。该方法准确、简便、可操作性强，适用于筛查降糖类保健食品中磺酰脲类、非磺酰脲类、噻唑脘二酮类等9种降糖药物的非法添加。