适配体在口腔癌诊断和治疗中的研究进展

张 娜,刘建国,王方远

(1.遵义医科大学 口腔医学院,贵州 遵义 563099;2.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室,贵州 遵义 563006)

口腔疾病是一个全球性公共卫生问题,困扰全球30亿～50亿人口,影响人体健康和生活质量,而且对人体其他组织器官也有广泛的影响,是导致糖尿病等全身性疾病的原因之一[1]。口腔癌是常见的口腔疾病之一,也是致死率最高的口腔疾病。针对口腔癌的病因、发病机制及治疗手段的研究,一直是研究人员的重点关注领域。随着更多的新技术、新材料和新方法被应用于口腔癌的基础研究和临床治疗中,诸多研究方向如纳米材料、光动力学疗法、光学成像、人工智能技术等都已成为口腔癌的研究热点[2-4]。

近年来适配体(aptamer)作为生物分子识别新材料,已经被应用于药物的研发、生物传感器构建、生物分子检测、疾病的诊断和治疗等各个领域[5],也引起口腔医学工作者重视,其在口腔癌诊断和治疗中的应用也已成为研究热点,现对近年来适配体在口腔癌诊断和治疗中的研究进展做一综述。

1 适配体

适配体也称核酸适配体,是一类通过“指数富集配体系统进化”(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术在体外来筛选得到的寡聚核苷酸序列,包括短的单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA),能与对应的配体进行特异性识别。作为分子识别元件,适配体通过折叠成不同的二级或三级结构,以高的亲和力与对应的靶标配体识别并进行特异性结合,其亲和力也常常高于抗原-抗体之间的结合能力,因此适配体也被称为“化学抗体”。与抗体相比,适配体优势明显,比如尺寸更小、易合成、合成成本低、方便通过固相化学合成进行多功能基团修饰、可通过物理吸附或化学键等多种方式来固定等优点,同时还具有设计灵活、高温下稳定、体外选择快速、低毒性、低免疫原性和更强的组织穿透性等优势。另外,其化学合成的生产方式使其应用牵涉的伦理问题更少,以上这些都表明适配体在很多方面比抗体具有更强的优势和适用性[6]。

目前,通过研究人员的多年工作,已经筛选得到成千上万种适配体,其靶标非常广泛,包括金属离子、化学小分子、多肽、蛋白质、细胞表面抗原,甚至整个细胞等,因此适配体在疾病诊断、药物传递和治疗等方面显示出巨大的潜力。例如:适配体已成功运用到抑制SARS-CoV-2病毒感染,辅助细菌肿瘤定位增强生物治疗,检测头颈部鳞状细胞癌、肺癌、胰腺癌等癌症中的肿瘤标志物,另外“Macugen”等多种适配体药物也已通过FDA批准上市[7-9]。

2 适配体在口腔癌诊断和治疗中的应用

适配体在多个领域的应用发展迅速,近些年已经在口腔癌诊断和治疗中得到了广泛的应用。口腔癌是头颈部最常见的癌症类型之一,约占所有恶性肿瘤的4%。据国际癌症研究机构报道,2020年口腔癌约有近38万新发病例和近18万死亡病例[10],其中约90%为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),其他部位原发性肿瘤的转移、黑色素瘤、肉瘤、恶性唾液腺肿瘤和牙源性肿瘤等恶性肿瘤约占10%[11]。OSCC在早期诊断并及时治疗后的5年存活率是80%左右,但其早期诊断困难,一般确诊时已发展为中晚期,而晚期诊断的患者5年存活率仅为20%或者更低[12],因此OSCC的早期诊断是提高存活率的最有效途径之一[13]。常见的诊断途径有影像学、病理检查、血液或唾液生化分析等[14],而生物样本中口腔肿瘤标志物的检测是口腔癌诊断的有效途径和常用途径,也是寻找有效治疗策略的关键手段。口腔癌生物标志物及其对应的适配体(表1)。

表1 口腔癌中常见生物标志物的适配体及其序列

2.1 外泌体 外泌体(exosome)是由细胞内多囊泡体与细胞膜融合后释放出来的细胞衍生囊泡,包含多种蛋白质、mRNA和非编码RNA等多种成分,具有细胞内通讯和信号传导等重要的生物学功能。肿瘤细胞来源的外泌体常是肿瘤的生物标志物,包含的特定信息可以激活肿瘤的发生发展和转移,与健康人的唾液外泌体(67.4 ± 2.9)nm相比,OSCC患者唾液中的外泌体(98.3 ± 4.6)nm的尺寸和CD63表面密度显著增加,其结构和形态畸变表明外泌体可以直接进入到OSCC患者的唾液中,因此唾液中外泌体含量与OSCC的发生、发展、转移和预后有关。OSCC患者的唾液外泌体包含着肿瘤的非侵入性诊断信息,具有靶向性高、组织渗透能力强等特点,因此唾液中的外泌体可以作为OSCC非侵入性诊断的生物标志物之一[15-16]。Wu等[17]通过外泌体表面蛋白CD63适配体(AptCD63)介导的杂交链式反应开发了一种基于磁性微球结合量子点的生物荧光探针MFBP(图1),用于唾液中外泌体的一步法高灵敏定量检测(检测限低至5×102颗粒/μL)。研究显示样本中约88.1%的外泌体被AptCD63成功识别并结合,这说明AptCD63上修饰的适配体与唾液中OSCC外泌体具有良好的结合效率,同时说明OSCC外泌体在唾液中的高表达。为进一步提高检测灵敏度和适用性,He等[18]以OSCC细胞(CAL27)衍生的外泌体为模型,使CD63适配体修饰的银纳米颗粒被富集到电极表面以产生强烈的信号,从而构建出一种灵敏检测唾液中CAL27外泌体的新方法,该方法将检测灵敏度提高了1倍多(检测限低至2.07×102颗粒/mL),说明该方法在临床上具有灵敏诊断OSCC的应用潜力。

示意图来源于参考文献[17]。

2.2 癌胚抗原 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是最先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关性抗原,存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞的表面,被用作多种癌症的生物标志物[19]。Zheng等[20]采用了酶联免疫吸附法测定血清和唾液样本中的CEA,发现OSCC患者唾液CEA水平与临床分期、淋巴结转移等相关,证实了唾液中的CEA水平可作为OSCC严重程度的指标,并可作为评估OSCC分期和淋巴结浸润程度的参考值,提示唾液中的CEA可以作为OSCC的诊断生物标志物。Shahbazi等[21]基于CEA适配体为识别元件,以DNA为模板自组装形成G-四链体结构的信号元件,该元件具有过氧化物酶活性,实现了对唾液中的CEA的简单、快速、可视化的高选择性定量检测,其检测限可以低至1 ng/mL。该方法为快速、可视化诊断OSCC提供了潜在的选择。

2.3 乙酰肝素酶 乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)是糖苷水解酶79家族的1种腺苷-β-葡萄糖醛酸酶,可以对硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素链进行裂解。HPSE在细胞外基质中大量表达导致细胞外基质的重塑,同时释放了与硫酸乙酰肝素结合的生长因子和细胞因子[22]。HPSE的异常表达已经在口腔癌、乳腺癌等各类癌症中观察到,它在癌症中有维持增殖信号、规避增长抑制因素、抵抗细胞死亡、无限复制、诱导肿瘤相关血管形成、激活癌症的侵袭和转移能力等作用,还可以促进炎症和癌症发展,并伴随患者预后不良[23]。Simimons等[24]报道了抗乙酰肝素酶适配体在OSCC的治疗和诊断的潜力,他们筛选出3个适配体(短1.5 M,长1.5 M和3.0 M),并且发现这些抗肝素酶适配体能够抑制与口腔癌相关肿瘤细胞的组织侵袭,并证实了这种抑制是由于抗乙酰肝素酶适配体对该酶的抑制,而不是由于适配体的其他潜在细胞毒性作用。研究还表明,虽然较长的适配体对肝素酶有更高的亲和力,而短1.5 M比长适配体具有更强的阻止肿瘤细胞入侵的能力,具有作为诊断和治疗OSCC的应用潜力。在上述的研究基础上,Väyrynen等[25]进一步比较了短1.5 M和抗乙酰肝素酶抗体的作用,发现二者都显著减少人舌鳞状细胞癌细胞的侵袭面积和侵袭深度,表明短1.5 M具有治疗人舌鳞状细胞癌细胞的潜力。

2.4 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是1种I型跨膜糖蛋白,属于酪氨酸激酶受体,具有促进细胞增殖、迁移和侵袭的作用。OSCC患者中有80%～90%过度表达EGFR,其高表达与OSCC患者的抗辐射性、预后不良以及治疗后低生存率有较高的相关性,可以作为诊断OSCC的生物标志物和治疗靶标[26]。Li等[27]筛选出EGFR的适配体E07(Kd=2.4 nM),E07与EGFR结合后阻断受体的自磷酸化,并在三维基质中阻止肿瘤细胞的增殖。此外E07很容易内化到表达EGFR的细胞中,可开发为1种很有前途的抗肿瘤药物或造影剂。随后,Melancon等[28]通过硫醇末端的适配体E07附着在空心金纳米球(HAuNS)表面,制备成靶向EGFR的Apt-HAuNS,结合药代动力学、生物分布和影像学研究,在头颈部鳞状细胞癌细胞中对比了适配体E07和EGRF抗体对EGFR的亲和性和靶向选择性。结果显示,适配体E07是1种比EGFR抗体更好的肿瘤靶向配体,可以靶向传递HAuNS,用于治疗过度表达EGFR的头颈部鳞状细胞癌。

2.5 循环肿瘤细胞和上皮细胞粘附分子 从原发肿瘤转移到循环系统的癌细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC),CTC具有独特的表型和基因型,使其能在循环系统中生存并参与血液循环,并随后扩散以形成继发性肿瘤。研究表明CTC作为液体活检的生物标志物在癌症早期诊断、治疗,以及癌症的扩散和转移、预后、疗效监测等方面有着重要作用[29]。上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)广泛表达于癌细胞源性CTC的细胞表面,因此常被用作CTC富集的靶点[30]。Chang等[31]报告OSCC患者中发现的CTC计数极高,并且CTC与OSCC的进展、预后及免疫状态显著相关。锁核酸修饰后的适配体具有更高的热稳定性、特异性,而且能提高细胞摄取和在血液中半衰期。Maremanda等[32]使用锁核酸修饰的EpCAM适配体制备简单的平面微流控装置,实现了对CTC高灵敏度(92%)和高特异性(100%)的快速捕获,证实EpCAM在头颈部肿瘤CTC中的高表达,表明该装置的快速捕获CTC的能力在OSCC的诊断、预后和制定治疗计划方面具有巨大的应用潜力。

2.6 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由157个氨基酸组成的同源三聚体蛋白,可以调节免疫功能并引起部分肿瘤细胞坏死,也可以通过诱导炎症和组织损伤促进肿瘤形成,为癌症生长和扩散创造有利环境,TNF-α还可以通过激活参与细胞增殖和存活的各种信号通路直接促进口腔癌细胞的增殖、迁移和侵袭[33]。鉴于TNF-α在潜在恶性口腔疾病的进展中的作用及其对恶性转化的调节,它已被提议作为口腔癌早期诊断的潜在生物标志物,通过监测患者的TNF-α水平有助于及早发现和治疗这些口腔癌或潜在恶性口腔病变[34]。Zou等[35]利用嵌入分子信标中的TNF-α适配体设计了1种高灵敏(检测限低至1 pg/mL)检测唾液TNF-α的电化学新方法,以实现对口腔癌的早期诊断。通过检测唾液中的TNF-α验证了该诊断方法的有效性,这有望成为一种监测口腔癌动态细胞因子浓度的非侵入性方法。

2.7 黑色素瘤相关抗原A3 黑色素瘤相关抗原A3(melanoma associated antigen-A3,MAGE-A3)在多种恶性肿瘤中表达,而在正常组织中不表达(除睾丸和胎盘外),具有肿瘤特异性。MAGE-A3的高表达与OSCC的浸润、侵袭性、淋巴结转移、癌症晚期分期等显著相关,可以作为OSCC诊断、治疗、预后的重要靶标和生物标志物[36]。Wang等[37]筛选出针对MAGE-A3(111-125)肽抗原的适配体Ap52和Ap16,其中Ap52适配体可与口腔癌及其他癌细胞结合,而不与正常/非癌细胞结合。研究表明Ap52和Ap16都在口腔癌细胞中具有靶向性。Wang等[38]发现经硫代磷酸酯修饰的Ap52与抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,Dox)的复合物可选择性地靶向传递入口腔癌等癌细胞,而游离Dox则可以被所有细胞系吸收。与相应的正常/非癌细胞相比,ThioAp52-Dox对癌细胞的细胞毒性得到增强。提示适配体Ap52可以作为治疗口腔癌等癌症的靶向治疗药物的识别基团,在药物开发方面有极大的前景。

2.8 C反应蛋白和乳酸脱氢酶 C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是1种急性期感染和炎症过程蛋白。慢性炎症导致肿瘤血管生成和DNA损伤,这两者都增加了CRP水平。肿瘤更大、肿瘤分期更晚的OSCC患者CRP水平越高,患者的总生存率降低[39]。提示CRP可以成为OSCC有价值的预后生物标志物。乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)也是1种蛋白质生物标志物。由于癌症发展的标志之一是有氧糖酵解,反映为LDH-5表达升高,而由于唾液中LDH主要来源于口腔上皮细胞并反映口腔上皮细胞的病理变化,唾液中LDH-5的水平可以用来确定OSCC的生物学行为和侵袭性,即LDH-5是OSCC的潜在生物标志物[40]。Minagawa等[41]筛选出了与人CRP和LDH-5具有高亲和力的适配体(KdCRP= 6.2 pM,KdLDH-5= 235 pM),并且在唾液样本中展现了与CRP和LDH的特异性结合的能力,其高亲和力和高特异性的特点可以为OSCC或者口腔炎症性疾病的诊断提供更好的识别基团。

3 展望

适配体具有体外快速选择、低免疫原性、易于化学合成和位点特异性修饰、物理尺寸小、热稳定性高、组织渗透性好等特点,为口腔癌的诊断、药物递送和治疗提供了更好的可能性,尽管适配体在口腔癌诊断和治疗等研究中的应用还处于发展中,但是其已显示出了巨大的应用潜力。同时,适配体在某些方面也显示了一定的局限性,如:目前筛选出的口腔癌肿瘤标志物适配体还较少,需要筛选出更多且具有更高亲和力的适配体,还需要进一步的研究和临床验证来确保适配体的稳定性、特异性和安全性,解决这些挑战将有助于适配体在未来口腔癌诊断和治疗等应用中发挥更大的作用,为未来的口腔健康卫生事业的发展做出更多的贡献。