经典名方当归补血汤物质基准的质量标准研究

谢晓林 李 娟 张德柱 马 钊 梁承远 凌 梅 乔乖萍 惠 楠

(1 陕西盘龙药业集团股份有限公司,西安,710021; 2 陕西科技大学,西安,710021)

经典名方研究是国家推动中医药产业发展的重要手段,2018年国家公布的《古代经典名方目录(第一批)》,掀起了经典名方的研究热潮[1-3]。当归补血汤是国家首批公布的经典名方之一,源自金元时期李东垣的《内外伤辩惑论》,是经典的补益剂[4]。其方为“黄芪一两,当归(酒洗)二钱。上件药,口父咀,都作一服。水二盏,煎至一盏,去渣,温服,空心食前。”方中黄芪大补肺脾之气,以滋生化之源,当归养血合营,二者合用,共奏益气补血之效[5]。主治血虚阳浮发热证,肌热面红,烦渴欲饮,脉洪大而虚,重按无力。亦治妇人经期、产后血虚发热头痛,或疮疡溃后久不愈合者[6]。现代研究还表明,当归补血汤具有抗肿瘤、抗疲劳、抗炎、抗糖尿病、保肝、保护心脑血管等药理作用[7-11]。此外,当归补血汤疗效确切、配伍简单,是中药复方制剂的研究热点。

本研究参照《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中的部分要求[12],研究了当归补血汤的基准样品,包括当归的炮制、药材前处理、煎煮、滤过、干燥等工艺参数,进行了当归补血汤基准样品中阿魏酸以及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定以及基准样品的薄层鉴别,为当归补血汤基准样品质量研究提供了科学依据,也为该经典名方研制成现代中药复方制剂提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津公司,日本,型号:LC-16);电子天平(0.1 mg)[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,瑞士,型号:LE204E/02];电子天平(0.01 g)(凯丰集团有限公司,型号:JCS-600);语盟牌超声波清洗机(深圳市方奥微电子有限公司,型号:YM-100S);集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器设备有限公司,型号:DF-101S);数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂,型号:HH-8);三用紫外分析仪(南京大卫仪器设备有限公司,型号:ZF-1);3L底盘加热式煎药壶(潮州市潮安区龙光电器有限公司,型号:30MF5)。

1.2 试剂与试药 毛蕊异黄酮葡萄糖苷(南京春秋生物工程有限公司,批号:MRYG20200813);黄芪甲苷(南京春秋生物工程有限公司,批号:HQJG20190126);藁本内酯(上海安谱实验科技股份有限公司,批号:91980008);阿魏酸(中国食品药品检定研究院,批号:110773-201915);色谱醇乙腈(Fisher Scientific,美国,批号:P2478474);色谱醇磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:H2110260);色谱醇甲醇(Fisher Scientific,美国,批号:P2470293);色谱级甲酸(麦克林,批号:G12966266);纯净水(陕西娃哈哈有限公司,货号:6222SS07116),色谱醇无水乙醇(麦克林,批号:C14789359);其他试剂均为分析纯,包括甲苯(西陇科学,批号:201029);乙酸乙酯(GENERAL-REAGENT,批号:G23272I);冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:G2121128);正丁醇(麦克林,批号:C14255485);三氯甲烷(浙化中星化工,批号:20201009)。

1.3 分析样品 当归补血汤处方药材黄芪和当归收集不少于3个产地,采集批次不低于15批,经检验,药材质量符合最新版《中华人民共和国药典》的标准[13]。将这15批黄芪和当归药材饮片进行分批组合,制备15批当归补血汤物质基准样品。见表1。

表1 15批当归补血汤物质基准制备用药材产地及批号

2 方法与结果

2.1 物质基准制备方法 根据《内外伤辨惑论》进行处方考证[4],查阅文献典籍考证历代度量衡的演变[14]。最终确定本方中一两折合现代剂量约为30 g,二钱约为6 g,一盏约为200 mL。同时,通过对煎煮工艺的考察[15-17],最终确定物质基准制备方法为:称取黄芪饮片30 g、酒洗当归饮片6 g,共36 g,置煎药锅中,加水400 mL浸泡30 min,武火煎煮30 min,放冷,滤过。另加水200 mL,文火煎煮30 min,放冷,滤过。将2次煎液合并,冷冻干燥36 h。即得15批当归补血汤物质基准样品,编号为DGBXT01～DGBXT15。

2.2 薄层色谱法鉴别

2.2.1 当归 称取当归补血汤物质基准样品粉末0.2 g于250 mL具塞锥形瓶中,加入甲醇10 mL,密塞超声提取1 h后取出,放冷、过滤,滤液水浴蒸干后加1 mL甲醇溶解,作为供试品溶液。另取炮制好的酒洗当归药材、当归对照药材以及阿魏酸和藁本内酯对照品适量,照2020版《中华人民共和国药典(一部)》当归项下鉴别法制备对照药材溶液以及对照品溶液[13]。

展开方法:按2020版《中华人民共和国药典·通则0502》薄层色谱法试验[13],在同一硅胶G薄层板上,用毛细管取上述对照药材及对照品溶液10 μL、供试品溶液15 μL依次点样,将点好的薄层板放入装有展开剂甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.2)的双槽展开缸中,上行展开10 cm后取出薄层板,晾干,在365 nm紫外光灯下检视。样品与对照药材以及对照品在相应的位置上呈现相同的荧光斑点。见图1。

图1 当归的薄层色谱法鉴别注:1.阿魏酸对照品;2.藁本内酯对照品;3.当归(酒洗)药材;4.当归对照药材;5～9.样品

2.2.2 黄芪 称取当归补血汤物质基准样品粉末0.5 g于250 mL具塞锥形瓶中,加入高纯水20 mL后超声20 min使溶解,用水饱和的正丁醇溶液30 mL萃取2次,15 mL/次,弃去水液,将合并的正丁醇液用5%碳酸钠溶液提取2次,15 mL/次,弃去水液,蒸干正丁醇液,用1 mL甲醇将剩余物溶解,以此为样品溶液。另取黄芪药材2 g,加水20 mL,加热回流30 min,滤过,滤液同法萃取制备对照药材溶液。称取适量黄芪甲苷对照品,按照2020版《中华人民共和国药典(一部)》黄芪项下鉴别法制备对照品溶液[13]。

展开方法:按薄层色谱法2020版《中华人民共和国药典·通则0502》试验[13],在同一硅胶G薄层板上,用毛细管吸取10 μL对照品溶液,20 μL对照药材以及供试品溶液依次点样,将点好的薄层板放入装有展开剂三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的双槽展开缸中,上行展开10 cm后取出薄层板,晾干后均匀喷上10%硫酸乙醇溶液,放入烘箱中,105 ℃加热至有清晰的斑点显现。样品与对照药材以及对照品在相应的位置上,日光下显相同颜色的斑点;365 nm紫外光灯下显相同的荧光斑点。见图2。

图2 黄芪的薄层色谱法鉴别注:1.黄芪甲苷对照品;2.黄芪对照药材;3～7.样品

2.3 阿魏酸的含量测定

2.3.1 色谱条件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以乙腈(A):0.2%甲酸(B)=20∶80为流动相等度洗脱,流速为0.5 mL/min;检测波长:316 nm;进样量:10 μL;柱温:35 ℃。理论塔板数:按阿魏酸峰计算不得低于3 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品适量于容量瓶中,加乙醇溶解并定容,即得。

2.3.3 供试品溶液及阴性样品溶液的制备 精密称取当归补血汤物质基准样品0.2 g于250 mL的具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇10 mL,密塞称重,加热回流提取1 h,放冷,用提取溶剂补足减失的重量后滤过,取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。精密称取不含当归的阴性对照样品0.2 g,同法配制阴性对照溶液。

2.3.4 专属性试验 分别取上述3种溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样分析。见图3。供试品色谱中与对照品色谱相应位置处有阿魏酸色谱峰,阴性样品不干扰测定,杂质峰与阿魏酸峰分离度良好,该方法专属性良好。

图3 阿魏酸的专属性试验色谱图注:A.阿魏酸对照品;B.样品;C.缺当归阴性样品;峰1.阿魏酸

2.3.5 线性关系考察 取阿魏酸对照品10 mg,置50 mL容量瓶中,加乙醇制备200.00 μg/mL的母液。取一定量的母液于容量瓶中,分别加乙醇稀释配制质量浓度为10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL的溶液。按“2.3.1”项下色谱条件测定,记录峰面积,进行线性回归。阿魏酸的线性方程为:Y=82 270.2X-379 574(r=0.999 5),表明阿魏酸在10～200 μg范围内有良好的线性关系。

2.3.6 中间精密度试验 取上述20 μg/mL的阿魏酸对照品溶液,按“2.3.1”项下色谱方法重复进样6次,计算阿魏酸色谱峰面积相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)为1.71%,表明阿魏酸有良好的进样精密度。

2.3.7 供试品溶液稳定性试验 取同一供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定,得阿魏酸色谱峰面积RSD为2.32%,表明样品24 h稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 取同一批当归补血汤物质基准样品,按“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液并按相应色谱条件进样,记录阿魏酸的色谱峰面积,计算含量以及RSD。结果测得阿魏酸的平均含量为0.418 1 mg/g,RSD为2.31%,表明有良好的重复性。

2.3.9 回收率试验 取“2.3.8”项下的当归补血汤物质基准样品6份,0.2 g/份,精密称定。分别加入100 μg的阿魏酸对照品,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,并按相应色谱条件进样分析,计算回收率。阿魏酸的平均回收率为100.64%,RSD为2.87%,表明该方法回收率合格。见表2。

表2 加样回收率结果(n=6)

2.3.10 样品测定结果 取15批当归补血汤物质基准样品配制供试品溶液,按上述色谱条件进样分析计算阿魏酸的含量。见表4。

2.4 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,0.2%甲酸水溶液为流动相B。梯度洗脱(0～20 min,80%A→60%A;20～35 min,60%A),流速0.5 mL/min,检测波长260 nm,进样量10 μL,柱温30 ℃。理论塔板数:按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算不得低于3 000。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量于容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 精密称取当归补血汤物质基准样品0.2 g于250 mL具塞锥形瓶中,精密量取10 mL甲醇,密塞称重,超声提取1 h,放冷,用提取溶剂补足减失的重量后滤过,取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。精密称取不含黄芪的阴性对照样品0.2 g,同法制成阴性对照溶液。

2.4.4 专属性试验 分别取上述3种溶液,按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。供试品色谱中与对照品色谱相应位置处有毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰,阴性样品不干扰测定。毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰与杂质峰分离度良好,表明方法有良好的专属性。见图4。

图4 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的专属性试验色谱图注:D.毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品;E.样品;F.无黄芪阴性样品;2.毛蕊异黄酮葡萄糖苷

2.4.5 线性关系考察 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品5 mg于100 mL容量瓶中,加甲醇溶解制得50.00 μg/mL的母液。量取一定量的母液于容量瓶中,加甲醇溶解稀释制备质量浓度分别为5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、40.00 μg/mL的溶液。按“2.4.1”项下的色谱条件测定,记录峰面积,进行线性回归。得毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性方程为:Y=82 179.6X-257 13.2(r=0.999 9),毛蕊异黄酮葡萄糖苷在5～50 μg范围线性关系良好。

2.4.6 中间精密度试验 取浓度为50 μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液,连续进样6次,按上述色谱方法进行测定,RSD为0.46%,表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷的进样精密度良好。

2.4.7 供试品溶液稳定性试验 取同一供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样分析测定,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰面积RSD为1.94%,表明样品室温放置24 h稳定。

2.4.8 重复性试验 取同一批当归补血汤物质基准样品,按“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件进样,记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰面积,计算含量以及RSD。结果测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均含量为0.555 4 mg/g,RSD为2.60%,表明重复性良好。

2.4.9 回收率试验 取“2.4.8”项下6份当归补血汤物质基准样品,每份约0.2 g,精密称定。分别加入50 μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液2.4 mL,按“2.4.2”项下方法配制供试品溶液,按相应色谱条件分析测定,计算回收率。毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为92.62%,RSD为1.85%,表明该方法有良好的加样回收率。见表3。

表3 加样回收率结果(n=6)

2.4.10 样品测定结果 取15批当归补血汤物质基准样品制备供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件进样测定样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。15批样品中2个待测成分阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量分别在0.068%～0.109%和0.057%～0.092%。见表4。

表4 样品含量测定结果(%)

3 讨论

3.1 薄层色谱法鉴别 本研究拟建立当归补血汤中阿魏酸、藁本内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷以及黄芪甲苷的薄层色谱法鉴别项,但毛蕊异黄酮葡萄糖苷斑点显色不清晰,最终选择阿魏酸和藁本内酯作为当归的定性鉴别项,选择黄芪甲苷作为黄芪的定性鉴别指标,建立的薄层色谱法鉴别方法中供试品制备方法简单易操作,所选择的展开剂对样品的分离度良好,得到的斑点清晰,耐用性良好。

3.2 流动相以及流速的选择 为了得到峰形良好,分离度良好的色谱峰,实验中考察了不同的流动相体系,包括乙腈和水的体系、甲醇和水的体系,也考察了不同的改性剂如磷酸、甲酸对峰形的影响。结果表明以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相洗脱系统得到的色谱峰峰形较佳,且各成分分离情况相对较好,故最终选定乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相。实验中还考察了0.5 mL/min、0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速进行洗脱,结果以0.5 mL/min的流速得到的色谱峰峰面积最大。

3.3 样品提取方法选择 本实验分别考察了不同体积分数的甲醇、乙醇以及水作为提取溶剂的提取效率。鉴于常用的提取方法为超声提取和加热回流提取,因此本实验还考察了这2种提取方式的提取效果。结果表明用50%的乙醇回流1 h提取阿魏酸的效果最好。用甲醇超声1 h和回流1 h提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷的效果无明显区别,为了操作简单,选择用甲醇超声1 h提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

3.4 小结 经典名方应用历史久远,各种共性、难点问题如处方考证、剂量换算、药材炮制、汤剂煎煮方式以及时间等较为复杂,文献考证并不能为所有问题提供确证性依据。因此,本实验在崇经尚典的基本原则下,秉承“遵古不泥古”的理念,从发展的角度去认识经典名方复方制剂的研发。本实验以古籍中记载的当归补血汤制备方法为依据,结合剂型、容器的度量衡及现代通用方法综合考虑来优化并确定最终的当归补血汤物质基准的制备方案[18-22]。对不同批次的当归补血汤物质基准进行质量标准研究,采用薄层色谱法和高压液相色谱法,建立了当归补血汤的定性鉴别和含量测定方法。该方法简单、准确、稳定,为后续当归补血相关制剂的研发以及质量标准研究奠定了基础。

利益冲突声明:无。