反向传播人工神经网络结合正交试验优化荷叶降脂方的提取工艺

王迪磊 宋乃琪 杨凯丽 杨麒琳 郭子硕 肖五庆 杨天姿 李鹏跃 杜守颖

(北京中医药大学,北京,102488)

高脂血症是一种常见的慢性疾病,且随着人们生活水平的提高,高脂血症的发病率呈现逐年增长的态势。高脂血症是指人体血液中的血脂含量超过正常的范围,表现为血液中胆固醇、三酰甘油含量过高或者高密度脂蛋白的含量过低,现代医学也称为“血脂异常”[1]。高脂血症是心血管疾病的一个重要诱因,与高血压、冠心病等多种疾病联系紧密[2-3],是现代医学研究中的疑难杂症,因此高脂血症对症药物的开发也成为医药工作者的研究热点。

荷叶降脂方由荷叶、菊花、枸杞子3味药组成,具有降低血脂、保护血管的功效,在临床上常以代茶饮或汤剂的方式供患者服用,用于治疗高脂血症、血管动脉粥样硬化等疾病,疗效明显。方中君药荷叶的主要成分为生物碱及黄酮类,现代研究表明荷叶中的生物碱类是其发挥降脂作用的主要活性成分[4-5],因此本研究选取荷叶碱作为含量测定的指标性成分进行后续试验。

当前,应用于中药最佳工艺或处方配比筛选的试验设计方法较多,如正交设计、均匀设计、人工神经网络优化法、星点设计、Box-Behnken设计等[6-7],不同方法各有优势,但也存在相应的局限性。如正交设计适宜于水平数<5的多因素多水平试验,均匀设计适宜于水平数较多的试验,星点设计、Box-Behnken设计适宜于变量为连续变量且试验次数较多的试验,而人工神经网络优化因其具有强大的非线性拟合能力尤其适宜于中药复方的复杂体系研究[8-9]。因此,本研究以荷叶碱含量作为评价指标,采用正交试验结合反向传播(Back Propagation,BP)人工神经网络优化法优选其最佳提取工艺参数,为该方后续医疗机构制剂的开发奠定研究基础,同时为正交设计-BP人工神经网络优化设计在中药制药领域的联合应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 赛多利斯电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,型号:BSA224S];电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司,型号:JM-B10002);Thermo高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,型号:Ultimate 3000]。

1.2 试剂 三乙胺(批号:212510)、乙腈(批号:205309)、甲醇(批号:213476),均为色谱纯,购自美国Fisher公司;娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司,批号:20210319)。

1.3 分析样品 荷叶碱对照品(99.8%,中国食品药品检定研究院,批号:111566-201907);荷叶(北京仟草中药饮片有限公司,批号:201208002);菊花(北京鹤延岭药业发展有限公司,批号:200815);枸杞子(北京鹤延岭药业发展有限公司,批号:201005)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Lot validation C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%三乙胺溶液(B)梯度洗脱(0～40 min:A 20%～70%,B 80%～30%);检测波长为270 nm;柱温为30 ℃;进样20 μL;流速1.0 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取荷叶碱对照品适量,加甲醇溶解并混匀,制成荷叶碱质量浓度为11.35 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 干膏粉与提取溶剂比例考察 本研究拟不改变提取用溶剂,仍采用水作为溶剂进行提取,同时模拟工业生产多功能提取罐的提取过程,采用回流装置进行提取。

称取3倍量处方饮片,加水回流提取,水提液浓缩至稠膏状态,60 ℃减压干燥,得干浸膏,碎成浸膏粉,过四号筛。分别称取干膏粉0.3 g、0.5 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超声45 min,滤过,取续滤液进行测定。由SPSS 19.0统计软件分析干膏粉与提取溶剂不同比例组的含测结果。统计结果显示,2种比例所得的荷叶碱含量差异无统计学意义(P>0.05),选择以25 mL甲醇提取0.3 g浸膏粉用于后续正交试验中各组提取物的含量测定。

2.3.2 超声提取时间的考察 称取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,分别超声30 min、45 min,滤过,取续滤液进行测定。由SPSS 19.0统计软件分析超声时间对指标性成分含量的影响,统计结果显示,2种方法所得的荷叶碱含量差异无统计学意义(P>0.05),因此选择超声时间为30 min。

供试品溶液的制备方法最终确定:称取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超声30 min,滤过,取续滤液即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 按照处方比例,制备不含荷叶的干膏粉,按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.5 专属性试验 取“2.2”“2.3”“2.4”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示,色谱峰分离良好,阴性样品在荷叶碱对照品相应色谱峰位置未检出色谱峰。表明本方法系统适用性及专属性均良好。见图1。

图1 荷叶碱高压液相色谱法色谱图(时间轴,单位min)注:A.对照品溶液;B.供试品溶液;C.阴性样品溶液;峰1荷叶碱

2.6 线性关系考察 取对照品母液,加入甲醇依次稀释为不同浓度,分别进样测定峰面积。以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归,得荷叶碱的回归方程为Y=1.196 4X-0.052 1,r2=0.999 5。结果表明,荷叶碱在1.135～45.400 μg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。见图2。

图2 荷叶碱峰面积和进样浓度线性关系

2.7 中间精密度试验 取“2.2”项下对照溶液,按照“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,测定荷叶碱的峰面积,计算相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)值。结果荷叶碱的RSD值为0.55%,此条件下仪器精密度良好(RSD<3%)。

2.8 供试品溶液稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样,测定荷叶碱的峰面积,计算RSD值。结果测得荷叶碱峰面积的RSD=0.84%,供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好(RSD<3%)。

2.9 重复性试验 取干膏粉6份,每份约0.3 g,精密称定,按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品,进样体积为20 μL,测定荷叶碱的峰面积,计算RSD值。结果测得荷叶碱含量为0.828 3 mg/g,RSD为1.68%,重复性符合实验要求(RSD<3%)。

2.10 回收率试验 取含荷叶碱为0.828 3 mg/g的同一批样品6份,约0.15 g/份,精密称定,精密加入荷叶碱浓度为0.113 5 mg/mL的对照品溶液1 mL,按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备,进样体积为20 μL,测定荷叶碱的峰面积,计算回收率,并计算RSD值。结果荷叶碱的加样回收率为99.90%～103.96%,RSD值为1.48%,符合实验要求(RSD<3%)。见表1。

表1 荷叶碱加样回收率

2.11 样品测定结果

2.11.1 吸水量考察 按照3倍处方量称取饮片置圆底烧瓶中,加入12倍量水(按饮片重量计)每隔30 min用300目尼龙纱布滤过,测定滤液体积,至体积不再减少为止,计算饮片的吸水倍量,结果显示饮片的平均吸水率为265%,约为饮片总重量的3倍。

2.11.2 正交提取工艺设计 参考临床使用方法,饮片用水提取,以水提物中荷叶碱含量作为考察指标,加水倍量、提取时间、提取次数为因素,每个因素设计3个水平。见表2。

表2 水提正交试验因素水平

2.11.3 含量测定 分别称取3倍处方量的饮片,按照正交试验因素水平表中各因素水平设计正交试验,按照“2.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定荷叶碱含量。见表3。采用SPSS 19.0统计软件对正交结果进行方差分析。见表4。

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析

由方差分析表可知,A因素(加水倍量)、C因素(提取次数)对荷叶碱转移率有极显著性影响,为主要因素;B因素(提取时间)没有显著性影响,各影响因素大小为C>A>B。由正交试验结果表可知:A因素、C因素各水平间差异较大,选择荷叶碱含量较高的A3、C3水平,B因素各水平间差异不大,结合实际考虑选择提取时间较短的B1。综上正交优选最佳工艺确定为A3B1C3,即12倍量水,提取3次,每次0.5 h。

2.11.4 基于正交试验的人工神经网络优化 以正交试验中加水量、提取时间、提取次数3个因素数值作为输入层,以荷叶碱含量作为输出层,运用SPSS 19.0统计软件编程建立BP人工神经网络。设置隐含层为1个,选择双曲正切传递函数(tansig)作为隐含层传递函数,线性传递函数(purelin)作为输出层传递函数对结果进行仿真输出,对三因素各组合进行综合评分。见表5,图3～4。

表5 BP人工神经网络函数训练结果

图3 综合评分结果预测

图4 因素重要性结果预测

由综合评分结果预测图可知,训练曲线相关性良好,表明训练结果准确可信。而因素重要性结果预测图表明人工神经网络预测各因素重要性为提取次数>加水倍量>提取时间,与正交方差分析结果一致。最终计算综合评分得到BP人工神经网络模型仿真优化最佳提取工艺:12倍量水,提取3次,1 h/次(A3B2C3)。见表5。

2.11.5 验证试验 称取3倍处方量饮片,按正交试验与BP人工神经网络所优选的最佳提取工艺参数,分别平行安排3组试验,测定出膏率及荷叶碱的含量,确定最佳提取工艺。见表6。

表6 验证试验结果

由试验结果可知2种工艺的荷叶碱含量大致相同,工艺A3B2C3(12倍量水,提取3次,1 h/次)与工艺A3B1C3(12倍量水,提取3次,30 min/次)比较出膏率增加约2%,结合生产实际,在2种工艺指标性成分含量及出膏率差别不大的基础上,建议选择时间短,耗能低的A3B1C3作为最终提取工艺。

3 讨论

人工神经网络是在对人脑组织结构和运行机制的认识基础上,模拟其结构和智能行为的一种工程系统,其适合研究非线性系统的特性为解决复杂问题提供了一种相对有效且简单的方法[10-11]。

荷叶、菊花、枸杞子作为常见的药食两用中药[12],在医疗与食品领域应用广泛。而高脂血症作为一种常见的慢性疾病,因此在治疗上药食同源类药物就具有其独特的优势。现代研究表明,荷叶、菊花、枸杞子均具有良好的降脂作用,荷叶总生物碱可显著降低血清中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇含量,升高高密度脂蛋白胆固醇含量,调节脂质代谢紊乱;菊花总黄酮能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,增加细胞的抗氧化能力;而枸杞多糖在降脂的基础上还具有防止动脉粥样硬化及心脑血管疾病的作用[13],因此也越来越多地被应用于高脂血症的临床治疗及食疗领域。

本研究以荷叶的主要降脂活性成分荷叶碱作为指标性成分[14],依据2020版《中华人民共和国药典》选取甲醇作为溶剂对其进行溶解[15],并对溶剂体积比和超声时间进行了考察,选取了最优的研究方法,重复性结果良好,表明方法稳定可行。

提取工艺的优化历来都对制药生产起着举足轻重的作用,是新药研发过程中的关键一步。而中药复方由于其成分众多,提取过程往往又会使多组分之间发生交叉化学反应,这也造成了中药复方提取过程的模型多是非线性的且机制较为复杂,因此会对很多分析方法的结果造成影响。而BP人工神经网络的一个显著特性是通用近似性,又称为万能表达定理,即有1个隐藏层的多层感知机可以精确表示任意连续有界函数或布尔函数,有2个隐藏层的多层感知机可以精确表示任意函数。因此,神经网络的非线性表达能力非常强,可以很好的近似数据中蕴含的非线性特征。另外神经网络具有互连性和结构可塑性的信息处理单元,因此不要求分析变量满足正态性及独立性等条件,且具有自组织、自学习、联想记忆等优良特性,对复杂体系的数据具有良好的适应能力,因此非常符合中药复方作用体系的规律性探究[16-17]。

正交试验虽然在优化工艺方面应用广泛,但受限于因素水平的设定,正交试验筛选出的最佳参数只能是已设水平的组合,因此可能只是较优组合而非最佳组合。本研究在各因素下分别设置了3个水平,适合于用正交试验对其进行分析概括,因其是复方同时又选取了BP人工神经网络优化的方式与正交试验进行互补,共同参考2种分析方法的结果,如此不需要在正交的基础上增加试验次数即可获得理想的试验参数组合,结果更加准确可靠,可操作性较强[18-19]。最终本研究的正交试验与人工神经网络在加水量及提取次数方面得出的结论一致,后续试验又对提取时间进行了考察验证,筛选出了最佳的提取工艺参数,可为后续的制剂开发奠定一定的研究基础[20]。

在中药新药或医疗机构制剂的研发过程中,长期以来在“唯成分论”的影响下,常采用有机溶剂替代水对有效成分进行提取、富集。这种提取溶剂的改变虽然能够富集有效成分,但由于中药成分的多样性、复杂性,这种改变也可能引起毒性成分的富集,从而带来安全性的风险,对痔血胶囊、仙牛健骨颗粒的研究均反映了这种风险[20-21]。因此,在对于来源于临床经验方的中药复方制剂的开发时要充分考虑人用经验,参照临床用药的工艺来进行制剂工艺研究具有更好的保障。荷叶降脂方来源于临床经验方,在临床上多以代茶饮或汤剂的方式应用,为了尊重临床用药经验,保障临床疗效,故在研究中提取溶剂仍以水为溶剂。

利益冲突声明:无。