小儿柴桂退热口服液对发热模型大鼠的退热作用和机制研究

洪 倩 马增春 王增慧 韩 莉 王 青 杨 阳

(1 徐州医科大学附属淮海医院/解放军陆军第七十一集团军医院,徐州,221004; 2 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京,100850)

小儿柴桂退热口服液是小儿外感发热后临床常用的退热中药复方制剂,由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黄芩、白芍、蝉蜕7味药材组方制备而成,主要用于治疗小儿发热、头身痛、流涕、口渴、咽红、溲黄、便干等症[1]。该药功效确切、不良反应较小且质量稳定,已被2020版《中华人民共和国药典(一部)》成方制剂收载。

本研究拟探讨小儿柴桂退热口服液对酵母发热模型大鼠的退热作用,并通过检测大鼠血清炎症介质以及下丘脑发热中枢介质的含量变化,阐明其作用机制,以期为临床合理用药提供数据支撑及参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD大鼠70只,2～3周龄,体质量160～180 g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司,实验动物合格证号:2008001649301。饲养于医院实验中心动物房,适应性饲养1周,饲养温度24～28 ℃,相对湿度60%～80%,通风良好。实验通过医院动物福利伦理委员会审核并批准(伦理审批号:LL-2019DW01)。

1.1.2 药物 小儿柴桂退热口服液(吉林敖东延边药业股份有限公司,批号:1810014),规格10 mL/支;右旋布洛芬口服混悬液(湖北唯森制药有限公司,批号:20180705),规格100 mL:2 g。

1.1.3 试剂与仪器 高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司,批号:20181128W),5 g/袋;白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶联免疫吸附试验检测试剂盒(北京晶美生物科技有限公司,批号:20161223);一氧化氮(Nitric Oxide,NO)检测试剂盒(硝酸还原酶法)(南京建成生物工程研究所,批号:20170227);髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)检测试剂盒(硝酸还原酶法)(南京建成生物工程研究所,批号:20170802);大鼠前列腺素E2(地诺前列酮,Prostaglandin E2,PGE2)酶联免疫吸附试验检测试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号:20161225);大鼠环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)酶联免疫吸附试验检测试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号:20160915);电子体温计[欧姆龙(大连)有限公司,型号:MC-686型];电子分析天平(最大载荷220 g,分度值0.1 mg)(Sartorius公司,德国,型号:Quintix 224-1CN);冷冻离心机(Eppendorf公司,德国,型号:Centrfuge 5840);全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司,型号:r-911);酶联免疫检测仪(常州三丰仪器科技有限公司,型号:BG-XM496)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 称取10 g干酵母,置于玻璃研钵,逐渐加入生理盐水研磨成均匀混悬液,定容,配制成20%酵母混悬液,现配现用。于造模实验前1 d测量大鼠肛温,将电子体温计末端涂少量开塞露,轻缓送入大鼠肛门约2 cm处,待温度计稳定发出蜂鸣声后读数,间隔30 min后再次测量1次,取2次测量的平均值作为大鼠基础体温。通过随机数字表随机选取9只大鼠作为空白组。造模实验开始前,其余大鼠以10 mL/kg剂量于大鼠皮下注射20%酵母混悬液,6 h后同法测量大鼠体温,选择体温较基础体温升高0.6 ℃以上者为造模成功大鼠。筛选造模成功大鼠45只,通过随机数字表随机分为5组,分别为模型组、布洛芬组(阳性药物对照组)、柴桂低剂量组、柴桂中剂量组、柴桂高剂量组,每组9只。

1.2.2 给药方法 分组后立即进行给药,空白组和模型组均给予0.75 mL/kg生理盐水溶液灌胃,布洛芬组给予0.75 mL/kg右旋布洛芬口服混悬液灌胃,柴桂低、中、高剂量组分别以1.25 mL/kg、2.5 mL/kg、5 mL/kg小儿柴桂退热口服液灌胃。

1.2.3 检测指标与方法 于注射酵母混悬液7 h(即药物干预后1 h)、8 h(即药物干预后2 h)后分别同法测量并记录各组大鼠体温。随后,以0.03 mL/kg剂量将10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉各组大鼠,迅速于腹主动脉穿刺采血5 mL,静置30 min后,置于离心机内,960×g,离心10 min,吸取上层血清,检测IL-1β、NO、MPO含量。采血后,立即断头处死大鼠,于冰上迅速剥离大鼠下丘脑部位,置于-70 ℃超低温冰箱内保存备用。称取各组大鼠下丘脑脑组织约5 mg，精密称定，置于玻璃匀浆器中，定量加入生理盐水溶液(脑组织与生理盐水质量比为1∶9)，研磨制成匀浆，置于离心机内，4 ℃，960×g，离心15 min，吸取上清液，检测PGE2、cAMP含量。

2 结果

2.1 小儿柴桂退热口服液对酵母发热模型大鼠体温的影响 实验结果表明,皮下注射20%酵母混悬液6 h后,各组大鼠体温均升高(>0.6 ℃)。与模型组比较,退热治疗1 h、2 h后各给药组大鼠体温升高幅度均有所降低(均P<0.01),且随着时间延长体温下降趋势越显著;退热治疗1 h后,柴桂各剂量组大鼠体温均显著高于布洛芬组(均P<0.01),退热治疗2 h后,柴桂低、中剂量组大鼠体温仍显著高于布洛芬组(均P<0.01),而柴桂高剂量组大鼠与布洛芬组大鼠体温差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组大鼠治疗前后体温比较注:与模型组比较,**P<0.01;与布洛芬组比较,△△P<0.01

2.2 小儿柴桂退热口服液对酵母发热模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量的影响 与空白组比较,除布洛芬组大鼠血清IL-1β外,其余各给药大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均显著升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较,布洛芬组、柴桂各剂量组大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均显著降低,差异有统计学意义(均P<0.01);柴桂各剂量组的效应强度与剂量正相关,但均弱于布洛芬组。仅柴桂高剂量组与布洛芬组大鼠血清IL-1β差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 治疗后2 h各组大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量比较注:与空白组比较,▲▲P<0.01;与模型组比较,**P<0.01;与布洛芬组比较,△P<0.05,△△P<0.01

2.3 小儿柴桂退热口服液对模型大鼠下丘脑脑组织PGE2、cAMP含量的影响 与空白组比较,除布洛芬组大鼠脑组织PGE2外,其余各给药大鼠下丘脑脑组织PGE2、cAMP含量均显著升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较,布洛芬组、柴桂各剂量组大鼠脑组织PGE2、cAMP含量均显著降低,差异有统计学意义(均P<0.01);柴桂各剂量组的效应强度与剂量正相关,但均弱于布洛芬组。柴桂高剂量组与布洛芬组大鼠脑组织cAMP差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 治疗后2 h各组大鼠下丘脑脑组织PGE2、cAMP含量比较注:与空白组比较,▲▲P<0.01;与模型组比较,**P<0.01;与布洛芬组比较,△△P<0.01

3 讨论

发热是由于疾病或病原体入侵机体引起的常见临床症状[2],其发生机制为外源性致热源激活机体免疫细胞产生大量的内源性致热源,通过发热中枢介质作用于下丘脑体温调节中枢,引起机体发热[3-4]。儿童正处于身体生长阶段,体温中枢系统发育不够健全,调节功能比较差,加之对疾病的抵抗能力偏弱,容易受到各种疾病及炎症等不良因素的侵袭,以致引起发热。通常情况下,父母亲会非常担心发热对孩子产生不良影响[5]。在临床实践中,使用解热类药物治疗儿童发热性疾病较为普遍。例如,布洛芬是发热儿童退热最广泛可用和最常用的非处方药之一,可有效退热且耐受性良好[6]。但是,解热类药物容易产生胃肠道出血、胃灼热、消化不良、恶心呕吐等不良反应;也有可能增加严重感染的死亡率、延长病毒消除时间并减弱机体对感染的反应[7]。且解热类药物还存在多种与药物相关的危害,例如:布洛芬等药物具有引起药物不良反应的可能[8];过量服用对乙酰氨基酚会导致心肾、血细胞损伤和新陈代谢紊乱,其还是引起急性肝功能衰竭最常见的原因[9];儿童使用阿司匹林会引发代谢性酸中毒、低血糖、嗜睡、昏迷和痉挛等,严重者甚至死亡。英国等国家已正式禁止使用阿司匹林治疗儿童发热[10-11]。因此,如何在儿童发热时选择较为安全有效的退热药物是儿科医护人员及患儿父母亟待解决的重要课题。

小儿柴桂退热口服液以《伤寒论》中柴胡桂枝汤为基础,加减部分性味中药组方,处方含有柴胡、桂枝、葛根、白芍、黄芩、浮萍、蝉蜕7味药材。柴胡性辛、苦,微寒,疏散退热、疏肝解郁、升举阳气;葛根性甘、辛,凉,解肌退热、生津止渴、升阳止泻;二者同为君药[1,18]。桂枝辛甘温煦、温通经脉、解肌散寒,协同白芍味酸敛阴、益阴敛营、缓急止痛;二者合用调和营卫,为臣药[12-13]。黄芩降泄燥湿、泻火解毒、善清邪郁之热,为佐药[14-15]。浮萍性辛寒,祛风行水、清热解毒;蝉蜕性甘寒,疏散风热、利咽透疹;二者合用退肺热,为使药[15-16]。以上诸药配伍合用,具有发汗解表、清里退热的功效。临床研究已证实,使用小儿柴桂退热口服液治疗小儿外感发热,可明显解除体内郁热,缓解头身痛、鼻塞、流涕等症状,具有退热平稳持续、起效快、恢复正常体温时间短、退热后体温不回升、安全可靠的特点[17-18];治疗小儿上呼吸道感染、外感高热惊风有效安全[15,19]。

常用的发热动物模型主要有酵母发热模型、脂多糖发热模型以及2,4-二硝基苯酚发热模型[20-21]。酵母属真菌类,其致热成分是全菌体及菌体内含的荚膜多糖和蛋白质;皮下注射可引起注射部位溃烂并引发剧烈炎症反应导致机体发热。其主要机制为破坏单胺类神经递质5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素之间的动态平衡,诱导发热,且发热能够持续较长时间[22-23]。酵母发热模型能够较好地模拟病理状态下的发热症状,适用于解热作用持久、药效较为显著的解热类药物研究[20],更适合用来考察清热药的解热作用[24]。

为进一步观察和阐明小儿柴桂退热口服液的退热作用和机制,本研究选择酵母发热模型大鼠进行动物实验。实验中,皮下注射20%酵母后6 h,大鼠体温显著上升,且在随后的2 h内保持上升且趋于稳定。使用小儿柴桂退热口服液灌胃给药后1～2 h,大鼠体温持续降低,表明小儿柴桂退热口服液具有较好的退热效果,但作用较为温和;且高剂量小儿柴桂退热口服液的退热效果与临床常用解热类药物布洛芬相当,故其较为适用于治疗儿童发热性疾病。

炎症反应是机体受到外界刺激后产生的病理反应。发热现象则是炎症和其他炎症状况的继发性影响[25]。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎症介质均是重要的内源性致热源,能够直接或间接增加下丘脑体温调节中枢PGE2、cAMP等发热中枢介质含量,上调体温调定点,导致体温升高[26-27]。NO存在于多种细胞及组织中,可参与多种病理生理反应。当机体发热时,体内IL-1β及NO含量明显增加[28]。MPO主要存在于中性粒细胞、单核细胞等髓系祖细胞中,能够抵抗机体内细菌和真菌蔓延、调节免疫反应,其活性高低可反映中性粒细胞浸润的程度及活性[29]。PGE2、cAMP均是下丘脑正向调节发热中枢介质。PGE2相关通路是致热源引起发热的必经共同路径,能够通过信号转导通路上调体温调定,其水平升高是感染性发热最主要的诱因之一[27]。在感染和损伤组织中IL-1β大量形成,通过增加PGE2合成从而触发下丘脑升高体温[30]。cAMP是接近体温调节终末环节的发热中枢介质[31];PGE2可诱导cAMP表达量显著增加,并相应调高温度设定点[32-33]。本动物实验结果表明,酵母发热模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO炎症介质以及下丘脑脑组织PGE2、cAMP的含量均显著升高,可见模型大鼠血清中产生大量的内源性致热源,其脑组织中也相应产生大量的发热介质,二者皆是致热和诱导发热的重要因素。应用小儿柴桂退热口服液干预后,大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量显著降低,进而显著下调下丘脑PGE2、cAMP水平,调低了体温调定点,降低了大鼠体温,即产生退热作用。

综上所述,小儿柴桂退热口服液能够降低酵母发热模型大鼠的体温升高,其退热机制与抑制IL-1β、NO、MOP等炎症介质的生成与释放,减少下丘脑发热中枢介质PGE2、cAMP的合成与释放有关。小儿柴桂退热口服液是较为理想的治疗小儿发热的中药复方制剂,值得临床推广使用。

利益冲突声明:无。