柴归汤对高血压小鼠血管紧张素转换酶2及肠道菌群的干预作用

朱红俊 徐 辰 龚少愚 毛爱琴 周春刚 陆 曙

(1 无锡市中医医院,无锡,214000; 2 江南大学医学院,无锡,214000)

原发性高血压是临床常见心血管疾病之一。我国成年居民的高血压患病率达到27.9%[1]。在原发性高血压的治疗领域,中医药的临床疗效的提高尚需要创新思路与方药。因此,我们基于五运六气理论将高血压分为阳明型、太阳型、厥阴型3型,进行分型治疗,临床疗效显著[2-4]。其中对脉象平弦的厥阴型高血压采用柴归汤治疗,在降低舒张压(Diastolic Blood Pressure,DBP)方面优于厄贝沙坦或氨氯地平单药治疗[4]。但是,对柴归汤干预高血压的具体机制尚不清楚。我们通过高盐诱导的小鼠高血压模型对柴归汤的作用机制进行了初步研究,发现调节血浆及肾组织的血管紧张素转换酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)水平,以及肠道菌群可能是柴归汤对小鼠血压水平的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取40只5周龄雄性C57BL6小鼠,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证编号:20170005022803),饲养于江南大学实验动物房[许可证号:SYXK(苏)2017-0052]。动物房环境清洁，通风设备良好。温度保持在20～25 ℃，相对湿度50%。所有小鼠在同等条件下分笼饲养，12 h灯光昼夜交替，饮食(普通标准饲料由江南大学动物实验中心提供)、饮水自由。高血压小鼠饲养及模型建立、分组干预在江南大学完成，本研究经动物论述委员会批准通过(伦理审查号:JN.No20191230c1300630〔373〕)。

1.1.2 药物 1)柴归汤灌胃药剂由无锡市中医医院制剂室提供。柴归汤由张仲景经方小柴胡汤和当归芍药散合方。小柴胡汤组成:“柴胡半斤,黄芩、人参、甘草、生姜各3两,大枣12枚,半夏半升。”[5]当归芍药散组成:当归3两,芍药1斤,茯苓、白术各4两,泽泻半斤、川芎半斤[6]。根据我们临床经验及《中国老年高血压管理指南2019》《中国高血压防治指南(2018年修订版)》,减去了甘草和大枣,人参用北沙参代替。参照《伤寒杂病论》合方时柴胡用量减半例,柴胡剂量由8两减少到4两。临床常用经方剂量换算以1两=3 g、1两=5 g、1两=15 g最为多见[7]。因此,我们取高剂量1两=15 g进行计算。最终柴归汤处方组成与剂量:柴胡60 g(批号:19123001)、北沙参45 g(批号:20021401)、姜半夏40 g(批号:20032101)、泽泻120 g(批号:2022201),从江苏亚邦中药饮片有限公司购入;黄芩45 g(批号:200301)、生姜45 g(市场鲜货)、当归45 g(批号:200323)、生白芍240 g(批号:200418)、茯苓60 g(批号:200404)、生白术60 g(批号:200404)、川芎120 g(批号:200316),从苏州天灵中药饮片有限公司购入。全方由无锡市中医医院制剂室制作成水煎剂。每剂煎成2袋,90 mL/袋。2)贝那普利(北京诺华制药有限公司,批号:X2872)由无锡市中医医院药房提供。采用生理盐水配置成0.2 mg/mL溶液。3)8%NaCl高盐饲料(南通特洛菲公司,货号:TP6032)。

1.1.3 试剂与仪器 Mouse ACE2 ELISA试剂(ABCAM公司,美国,批号:GR3326353-1);肾脏组织ACE2 ELISA试剂(RB公司,美国,货号:DRE-M3394c);肾素ELISA试剂(RB公司,美国,货号:DRE-M0560c)。无创血压测量系统(IITC Life Science公司,美国,型号:Mrbp-mmc);冷冻高速离心机(Thermo Fisher,美国,型号:Fresco 17);酶标仪(Bio Tek Instruments,美国,型号:ELx800)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只C57BL6小鼠预适应1周后,按照无特定病原体(Specefic Pathogen Free,SPF)级饲养标准适应性饲养,进行标号并分为对照组10只和高盐组30只。其中对照组饲喂正常的饲料和水,高盐组先喂高盐饲料1个月,1个月之后3 d测1次血压,检测血压达到高血压标准后,开始通过尾压法连续测血压,观察小鼠的血压变化情况。当小鼠收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)持续稳定维持在130 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上时,表明高血压模型诱导成功。建模成功后,随机抽取10只小鼠作为模型组。其他20只高血压模型小鼠随机分为贝那普利干预组(贝那普利组)、柴归汤干预组(柴归汤组)。

1.2.2 干预方法 柴归汤组每只小鼠给予灌胃1次/d。按照人体标准体质量60 kg,换算后,每20 g体质量小鼠给予灌胃柴归汤0.5 mL。贝那普利组小鼠给予灌胃贝那普利0.2 mg/mL水溶液,1次/d,按照小鼠体质量6 mg/kg给药。干预期间,每周检测1次血压并记录,连续干预4周。

1.2.3 检测指标与方法 1)血压异常指标:本研究通过尾压法测量小鼠的SBP和DBP。使用了啮齿动物无创血压测量系统。2)将小鼠肾脏组织存储在-80 ℃冰箱中。检测前,预先在低温环境下各组小鼠均取1个完整肾脏组织,-80 ℃保存备检。检测时,首先将全自动快速研磨仪的模块和研磨珠放置于-20 ℃冰箱中冷却。将预先称重好的小鼠肾脏和3粒研磨珠置于无RNA酶的2 mL离心管中,并加入预冷的1 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS),将该离心管置于预冷的模块中并在研磨仪上固定。设置参数为1 500 r/min,运行20 s,间隔10 s,重复3次,得到小鼠肾脏匀浆。然后于冷冻高速离心机,12 000 r/min,离心半径5 cm,离心20 min,取上清备用。3)血浆ACE2水平、肾脏组织肾素和ACE2水平:血浆ACE2水平、肾脏组织肾素和ACE2水平采用酶联免疫吸附试验测量。血清及组织匀浆酶联免疫吸附试验检测均在无锡市中医院心血管疾病实验室采用酶标仪测定。4)苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色观察:肾脏组织HE染色委托本院病理科完成。5)肠道菌群检测方法:肠道菌群丰度委托武汉华大医学检验所有限公司进行检测。

2 结果

2.1 各组小鼠血压情况比较 每周重复血压测量显示,随着时间的变化,柴归汤和贝那普利可持续稳定降低小鼠SBP和DBP水平,差异有统计学意义(P<0.001)。见图1～2。

图1 柴归汤对高血压小鼠收缩压(SBP)的干预作用注:组间重复测量方差分析,F=25.266,P<0.001

图2 柴归汤对高血压小鼠舒张压(DBP)的干预作用注:组间重复测量方差分析,F=19.369,P<0.001

2.2 干预4周后各组小鼠血压和血浆ACE2的水平比较 干预4周后,柴归汤组、贝那普利组、对照组的SBP、DBP水平均显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。柴归汤组、贝那普利组、对照组血压水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,模型组血浆ACE2水平显著下降;贝那普利、柴归汤则升高了高血压小鼠降低的血浆ACE2水平,且贝那普利组血浆ACE2水平高于柴归汤组;差异均有统计学意义(均P<0.001)。见表1。

表1 干预4周后各组小鼠血压及血浆ACE2水平比较

2.3 各组小鼠的肾脏组织病理观察和肾脏组织肾素、ACE2水平比较 各组小鼠的肾组织病理HE染色差异无统计学意义。模型组、贝那普利组、柴归汤组的肾脏组织肾素、ACE2水平及其比值均低于对照组;干预后柴归汤组、贝那普利组的组织肾素、ACE2水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。柴归汤组和贝那普利组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3,表2。

表2 各组小鼠肾组织肾素、ACE2水平及其比值的比较

图3 各组小鼠的肾脏组织病理观察比较(HE染色,×25)

2.4 肠道菌群16S分析 相对于对照组,高血压组小鼠肠道Bacteroidia菌群丰度降低,而Clostridia菌群丰度升高。柴归汤组和贝那普利干预后,高血压小鼠降低的肠道Bacteroidia菌群丰度升高了,而升高的肠道Clostridia菌群丰度降低了。组间Beta多样性分析(非加权UniFirac法),模型组和贝那普利组的菌群多样性差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 肠道菌群丰度多样性比较注:模型组和贝那普利组的菌群多样性比较,P=0.026;Blank.对照组;NN.模型组;N.BNPL.贝那普利组;N.CGT.柴归汤组

3 讨论

厥阴型高血压患者的脉象特点是弦而不沉,适合柴归汤治疗。通过超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用对柴归汤的化学组学和代谢组学进行分析,我们确定了柴归汤的174个功效成分[5]。但是,柴归汤对高血压的干预机制尚不清楚。

高血压的动物模型目前常用的有自发性高血压大鼠模型,以及通过高盐诱导、L-name诱导或血管紧张素2(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导等建立的小鼠高血压模型。本实验通过高盐饮食诱导的高血压小鼠模型,SBP保持在125～150 mm Hg、DBP保持在95～130 mm Hg,较好地模拟了高血压的病理状态。同时,高盐诱导的高血压小鼠,血浆ACE2水平及肾组织的肾素/ACE2的比值显著下降;且肠道Bacteroidia菌群丰度降低,而Clostridia菌群丰度升高。因此,高盐诱导的高血压小鼠,其血压升高的机制和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone Aystem,RAAS)、肠道菌群紊乱等机制有关,这与文献[6-9]研究一致。

本文通过小柴胡汤和当归芍药散的合方——柴归汤对此模型进行了干预。干预研究结果显示,对于高盐诱导的高血压小鼠,柴归汤可以稳定降低SBP和DBP水平,干预4周的降压效果与高剂量贝那普利(相当于人40 mg/d)相当。其作用机制和柴归汤升高高血压小鼠异常降低的血浆ACE2水平和肾组织的肾素/ACE2的比值、改善高血压小鼠紊乱的肠道菌群丰度有关。而ACE2是肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin System,RAS)重要组成部分,促进血管紧张素(Angiotensin,Ang)(1-7)生成并结合mas受体舒张血管[10-11]、抗衰老[12]。通过ACE2-Ang(1-7)-Mas轴探讨原发性高血压中医证候实质也是研究方向之一[13]。研究证实,小柴胡汤可以降低高血压患者的血压[14-15],其主要活性成分与ACE2均有较强的结合力[16],当归芍药散加味可以显著提高左旋氨氯地平治疗高血压的疗效[17],也显著提高对妊高征的治疗效果[18]。

本研究中,柴归汤显著升高了高血压小鼠的血浆ACE2水平,提示干预RAS是柴归汤治疗高血压的作用机制之一。而通过调节肠道菌群来发挥治疗作用是中医药等天然药物的治疗方式之一。本研究提示,柴归汤可以升高高血压小鼠异常降低的肠道Bacteroidia菌群丰度,并降低异常升高的肠道Clostridia菌群丰度。因此,通过调节肠道菌群是柴归汤降低小鼠血压的另一个机制。但是,肠道菌群和ACE2之间的关联尚需要进一步研究。

综上所述,柴归汤对高盐诱导的高血压小鼠具有良好的降血压作用。其作用机制与升高血浆ACE2水平并调节肠道菌群有关。这在我们文献查阅中未见有相关报道,将为研究五运六气理论和张机经方治疗高血压的机制提供新思路。

利益冲突声明:无。