26个香菇菌株的遗传多样性ISSR分析

吴小燕, 鲍红春, 李小雷, 于海滨, 王海霞, 于传宗, 庞 杰, 王 锋

(1.内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特 010000; 2.内蒙古自治区农牧业技术推广中心, 呼和浩特 010000;3.内蒙古自治区农牧科学院, 呼和浩特 010000;4.鄂尔多斯市东胜区罕台镇社会治理综合服务中心, 内蒙古 鄂尔多斯 017000)

香菇[Lentinulaedodes(Berk.) Pegler]隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、小香菇属[1]。在我国南北方有不同的俗称,北方多称为香菇,南方又称为香蕈、香信、冬菇、花菇等。香菇是一种传统食、药用菌,我国栽培时间久,现已成为我国栽培面积最大的食用菌之一,因其富含人体所需的膳食纤维、蛋白质、氧化酶和维生素等成分,具有很高的经济、营养价值。另外,香菇中的香菇嘌呤、不饱和脂肪酸、维生素D原等药用价值高,长期食用能够增强人体免疫功能、预防心血管疾病、抗肿瘤、抗衰老,降低血脂[2]。目前香菇在实际生产中,品种是影响产量及品质的重要因素。近年来,虽然我国香菇育种工作发展迅速,培育出了一批质优、抗逆性强的优良品种,但地域小气候会对香菇生长产生很大影响,现有优良品种不能完全满足生产需求。内蒙古自治区香菇产业虽然栽培品种多,但大多数菌种都是从区外引进,真正具有自主知识产权,可用于大规模推广的优良品种甚少。生产用菌种普遍退化、老化,综合性状差,生产效率低;菌种混杂、种源混乱不清问题严重。目前,内蒙古自治区西部地区栽培的主要菌株仍是808和9608,优良品种单一、出菇期相对集中,生产效益欠佳,优良菌株的筛选、鉴定及新品种选育工作迫在眉睫。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)分子标记是在Zitkiewicz等[3]的基础上通过使用3′或5′锚定引物发展的一项技术。ISSR技术稳定、可重复、符合孟德尔遗传规律、多为显性标记、比其他分子标记更实惠、更有效,而且无须知道被测生物体的基因组序列。近年来,广泛用于香菇的遗传多样性分析、品种鉴定、系统发育、连锁图谱的构建等研究[4],陈小敏等[5]通过ISSR分子标记技术对四川省收集的菌株进行聚类分析,说明四川省野生香菇资源遗传多样性丰富。宋莹等[6]采用ISSR分子标记技术分析了辽宁省主栽的20个香菇菌株的遗传差异性,为辽宁省香菇遗传育种工作奠定了基础。使用ISSR技术明确保存的香菇种质资源之间的亲缘关系。本研究以区内外收集的26个香菇菌株为试验材料,对26个香菇菌株进行ISSR分子标记分析,了解它们的亲缘关系,为今后的香菇杂交育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

26个供试菌株来自全国不同育种机构,现保存于内蒙古自治区园艺研究院,其编号与来源见表1。

1.2 研究方法

1.2.1菌种活化

将实验室4 ℃保存的香菇菌株取出,将各菌株的菌丝体在25 ℃条件下,置于直径9 cm的培养皿中,培养7～10 d,收集菌丝[5-7]。

1.2.2DNA提取与检验

采用真菌基因组提取试剂盒(Biospin)从26份香菇菌丝中提取基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度,将基因组DNA稀释至100 ng/μL,-20 ℃保存备用。

1.2.3ISSR分子标记引物

试验所用引物来自参考文献[8],由上海生工生物工程公司合成。引物具体信息如表2。

表2 ISSR引物产品信息Table 2 ISSR primer product information

1.2.4ISSR-PCR扩增

扩增体系(25 μL):稀释后的ISSR引物和DNA模板各1 μL、12.5 μLTaqPCR Master Mix,剩余部分用ddH2O补齐。

扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,48 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.5引物筛选

以菌株阜平XG-31和XG 168的DNA为模板,24对ISSR引物进行PCR扩增,扩增后选择谱带清晰且间距均匀,多态性强的引物。

1.2.6数据分析

读取扩增电泳图数据,同一迁移位点上清晰条带记为“1”,无带记为“0”,建立“0-1”矩阵[9-10]。使用PopGen 32软件计算所有材料的等位基因数(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles,Ne)、基因多样性指数(Nei’s gene diversity,H)、Shannon信息指数(Shannon’s Information,I)。运用统计分析软件NTSYS-pc 2.10 e构建UPGMA聚类图谱,计算Nei’s 遗传距离(Nei’s genetic distance,D)[11-13]。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测结果

DNA电泳检测结果(图1)表明,各材料均出现了1条清晰、无拖尾的DNA条带,这说明用试剂盒提取的DNA纯度高,完整性好,无降解现象,能够满足后续实验要求。

图1 26个香菇材料基因组DNA纯度检测结果Fig.1 Genomic DNA purity test results of 26 Lentinula edodes materials

2.2 ISSR引物扩增结果

筛选出的10条引物在26个香菇菌株中共扩增出67条多态性片段(图2、图3),多态性比率为95.71%(表3)。每个引物扩增条带范围5～12条,平均每个引物7条。其中引物P 3和P 5分别扩增9条和12条条带,是扩增条带最多且多态性达到100%的引物;引物P 12和P 17扩增出的多态性条带最少,只有4条,多态性为80%。综合表明,26个香菇菌株具有丰富的遗传多样性。

图2 引物P 1对部分香菇菌株扩增结果Fig.2 Primer P 1 amplification results of partial Lentinula edodes materials

图3 引物P 17对部分香菇菌株扩增结果Fig.3 Primer P 17 amplification results of partial Lentinula edodes strains

表3 26份供试香菇材料的ISSR引物扩增结果Table 3 ISSR primer amplification results of 26 test Lentinula edodes materials

2.3 遗传多样性分析

26个供试菌株的有效等位基因数变幅介于1.630 6～1.958 0之间,均值为1.807 2,基因多样性指数变幅介于0.387 9～0.489 3之间,均值为0.445 0,Shannon信息指数变幅介于0.576 4～0.682 4之间,均值为0.630 8(表4)。

表4 26份供试香菇材料的遗传多样性分析Table 4 Genetic diversity analysis of 26 test Lentinula edodes materials

26个供试菌株的遗传距离变幅介于0～0.749 9之间(表5),各材料间的遗传差异较大。

表5 26份供试香菇材料的遗传距离矩阵Table 5 Genetic distance matrix of 26 test Lentinula edodes materials

2.4 ISSR聚类分析

聚类分析图结果(图4)表明,26个菌株间的遗传相似水平变化范围在0.51～0.99之间,总体相似性为51%,相似系数越小,亲缘关系越远,遗传多样性越明显。遗传相似系数小于0.51时,所有的供试菌株聚为一类。其中,XG-Y和阜平香菇0912;HXG-8 L 1和庆元香菇;遵化香菇168和平泉香菇168之间的遗传相似系数最大,表明遗传相似程度最高,遗传距离最近,遗传相似系数达到0.99。在遗传相似系数为0.678时将供试菌株分成4个类群,第一类群包括XG 168、MXG-4、XG-12、JXG-238、林西香菇、XG-Y、阜平香菇0912、MXG-1669、河南雨花、WYXG-215、冬香4号、冬香5号、香菇808、台湾香菇60、HXG-8 L 1、庆元香菇、X-0912、MXG-148 abc、LXXG-1611、遵化香菇-808、平泉香菇-168、遵化香菇-168、阜平XG-31;第二类群由沁阳雨花组成;第三类群由灵仙香菇组成;第四类群由宝林2号组成。沁阳雨花、灵仙香菇、宝林2号与其他香菇菌株间亲缘关系较远。

图4 26份香菇材料的ISSR遗传关系聚类分析Fig.4 ISSR genetic relationship cluster plot of 26 Lentinula edodes materials

3 讨论与结论

ISSR分子标记技术已广泛用于香菇菌株的鉴定,为分子水平上识别鉴定菌株提供了技术支持。肖东来等[14]利用ISSR技术对17个栽培菌株和3个野生菌株进行遗传多样性研究发现,多态性条带占90.82%。郭金英等[15]用6个引物对40个香菇菌株进行扩增,平均每条引物扩增的条带数在10～15条之间。本试验用10对引物对26个菌株进行扩增,每个引物扩增条带5～12条,参试菌株多态性条带占比为95.71%,这与肖东来等[14]、郭金英等[15]的研究结果一致,表明ISSR分子标记技术使用较少引物可获得的多态性条带较多。供试菌株遗传距离变幅介于0～0.749 9之间,名称相似或来自同一地区栽培的品种大多数会聚为一类,亲缘关系较近。

在遗传相似系数为0.99时,XG-Y和阜平香菇0912、HXG-8 L 1和庆元香菇、遵化香菇168和平泉香菇168亲缘关系最近,在遗传相似系数为0.678时将供试菌株分成4个类群,沁阳雨花、灵仙香菇、宝林2号各自为一个类群,与其他香菇菌株遗传差异较大,可作为香菇品种选育的基础材料。但其他23个菌株间遗传相似系数高,说明供试菌株遗传背景较单一。在今后的育种工作中,需收集更多优质菌株,拓宽遗传基础,通过育种材料合理配置,为香菇主栽品种的遗传改良和培育具有自主知识产权的优良菌株奠定基础。