温度调控对大口黑鲈性腺发育的影响

2023-07-31李胜杰连总强王旭军白富瑾杨立强杨瑞兰吴旭东

淡水渔业 2023年4期

杨刚，李胜杰，连总强，刘哲，王旭军，白富瑾，杨立强，，杨瑞兰，，柳婷，，吴旭东，

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.宁夏回族自治区水产研究所，银川 750001；3.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广州 510385；4.宁夏新明润源农业科技有限公司，银川 750001；5.宁夏回族自治区水产技术推广站，银川 750001)

性腺发育作为鱼类繁殖的前提，其受温度、光照、营养、密度、pH等因素的影响，温度和光照在鱼类性腺发育中起主导作用，温度调控对鱼类性腺发育的影响因鱼的种类而异[1]。已有研究表明，温度对性腺分化、发育和产卵均有影响，在性腺分化时高温或低温会改变鱼类雌雄比例，在性腺发育时适宜的升温或降温会促进或抑制性腺发育和成熟，进而影响产卵[2]。如厦门文昌鱼(Branchiostomabelcheri)水温从16 ℃提高至28 ℃性腺发育速度显著加快[3]，(Miichthysmiiuy)提高水温可使卵巢快速发育并提前产卵[4]；但对产卵后的四川华鳊(Sinibramataeniatus)雌鱼进行11 ℃低温养殖，发现卵母细胞发育不良，大量卵泡出现闭锁现象[5]；库达海马(Hippocampuskuda)幼鱼在18 ℃和20 ℃条件下饲养时，卵巢发育停滞于Ⅱ期或Ⅲ期状态[6]。因此温度调控对鱼类性腺发育和成熟以及实现全年繁育具有重要意义。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)俗称加州鲈，原产于美国加利福尼亚州，具有肉质鲜美、无肌间刺、生长迅速、适温范围较广等优点[7-9]，自20世纪80年代引入广东地区并成功繁殖后，现已成为我国重要的淡水养殖品种之一[10]。近年来宁夏等北方地区大口黑鲈养殖发展快速，养殖规模逐年扩大，但苗种主要从华南和华中地区引进，存在一苗难求、质量不一致、病害多发、成活率不高等问题[11]。有关报道显示，大口黑鲈在自然条件下一年仅繁殖一次[12]，广东、江浙等沿海地区大口黑鲈在3-5月产卵[13，14]，安徽、新疆等地区4月下旬至5月上旬水温在18～25 ℃时产卵[15，16]，宁夏地区4月下旬至5月中旬水温达到18～23 ℃时产卵。由于北方地区大口黑鲈鱼苗下塘时间晚，养殖有效期短，存在当年不能养成上市、越冬死亡率高的问题[17，18]，若能在宁夏地区开展大口黑鲈反季节苗种繁育，使苗种在室内培育至翌年早春3-4月达到(50～150)g/尾下塘，可在7-9月份上市并高价销售[19]，既实现结构调整所需苗种本地化生产又历史性地实现“北苗南运”，促使大口黑鲈养殖产业效益最大化。已有研究报道，华中地区通过控温实现了大口黑鲈9-10月份二次产卵[20]，培育大规格越冬苗种，大大提前了上市时间并填补了7-9月市场缺鱼期。本实验通过开展宁夏地区大口黑鲈“优鲈3号”自然和人工控温条件下性腺发育及性激素水平变化规律及人工控制反季节苗种繁育技术研究，以期为破解西北地区大口黑鲈养殖产业高质量发展面临的苗种适时规模供给瓶颈提供重要的技术支撑，为大口黑鲈性腺发育及周年繁育研究提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 实验鱼及实验条件

实验鱼为宁夏地区引进培育的大口黑鲈“优鲈3号”亲本，人工驯养1年以上，年龄≥1龄，体质健壮，无病无伤，体质量(550±50)g，体长(25.4±1.7)cm。实验鱼先在室外池塘培育，后转入室内水泥池培育。室外池塘养殖面积为7 000 m2、水深2 m，放养密度约800尾/667 m2，培育用水为黄河水，pH 7.8～8.2、氨氮0.05～0.20 mg/L、亚硝酸盐0.01～0.15 mg/L、溶氧5.5～8.0 mg/L；室内水泥池体积为100 m3，放养密度为25尾/m3，培育用水为地下水(水温12～13 ℃)，pH 8.0～8.2、溶氧5.5～7.0 mg/L、氨氮0.01～0.20 mg/L、亚硝酸盐0.01～0.20 mg/L。

1.2 实验设计

2022年4月1日-5月7日在室外池塘养殖1龄大口黑鲈，分为控温组和对照组，控温组采用室外池塘上方加盖遮阳保温材料控制水温，对照组为不做任何处理的露天池塘。5月8日将室外池塘控温组和对照组实验鱼分别转入设施温棚车间水泥池内继续控温[(14±1)℃]培育至大口黑鲈性腺发育至Ⅴ期后升温至20 ℃进行反季节繁殖实验，各组随机挑选80尾(雌雄比为1∶1)分别置于直径为8 m的圆形养殖池产卵，将每天收集的受精卵置于面积为12 m2的孵化池中孵化，孵化水温为23 ℃。实验期间每天9：00投喂一次大口黑鲈亲鱼专用配合饲料，投饵率为0.2%～0.5%。外塘水温每天取6：00、12：00、18：00、24：00水深1 m处水温的平均值为当天水温(对照组11.1 ℃～17.7 ℃，控温组5.4 ℃～11.4 ℃)。

1.3 样品采集

室外培育期间第8、16、24、30天各采集一次性腺、血清样品，室内培育期间第1天和第30天各采集一次性腺样品，样本数量均为雌雄各5尾。将随机捕获的实验鱼用2-苯氧乙醇麻醉，测量体质量，尾静脉采血1.5 mL，解剖鱼体采集性腺组织并测量质量，同时取约1 cm3小块性腺组织置于Bouin′s液固定48 h后用于制作组织切片。血液在4 ℃自然凝固4～6 h后3 500 r/min离心10 min，取上清保存于-20 ℃用于性激素测定。繁殖期统计一周内产卵量、受精率和孵化率等指标。

1.4 血清中性激素测定

用酶联免疫吸附测定(Elisa)试剂盒(江苏雨桐生物科技有限公司)双抗体夹心法测定血清中雌二醇(E2)和睾酮(T)水平。试剂盒内含带有对应激素抗体包被的微孔板，血清激素与微孔板中的抗体结合后，经彻底洗涤后加底物TMB并利用HRP酶催化显色，使用酶标仪测定450 nm的波长下吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中激素水平。具体方法参见试剂盒内说明书。

1.5 性腺组织学观察

固定好的性腺样品经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，YD-202轮转式切片机连续切片(5～8 μm)形成蜡带，苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，Motic A131显微镜拍照观察。性腺分期标准参照崔庆奎等[20]的方法。

1.6 数据处理

结果用“Mean±SD”表示，用SPSS 25.0(IBM SPSS Statistics，Version 25)统计软件对试验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性检验，然后用Duncan’s多重比较来确定组间差异的显著性，P<0.05表示差异具有统计学意义。用Excel软件制作图表。相关计算公式如下：

性腺指数(GSI)=WG/WB×100%

受精率(FR)=受精卵数/总卵数×100%

孵化率(HR)=出膜苗数/受精卵总数×100%

式中，WG和WB分别为实验鱼性腺质量和体质量，单位g。

2 结果与分析

2.1 室外培育大口黑鲈性腺指数(GSI)变化

室外池塘培育期间雄性大口黑鲈GSI呈现上升趋势(图1)，其中对照组GSI变化范围为0.47%～0.77%，控温组GSI在第24天之前呈缓慢上升趋势，仅上升了0.10个百分点，后显著上升至0.57%。雌性大口黑鲈GSI变化趋势和雄性相同(图2)，对照组GSI变化范围为8.17%～11.95%，控温组GSI变化范围为4.48%～8.45%。对照组雄性大口黑鲈GSI在室外池塘培育期间前24 d内显著高于控温组，对照组雌性大口黑鲈GSI在室外池塘培育期间显著高于控温组。

2.2 室外培育大口黑鲈性腺组织学观察

大口黑鲈精巢发育组织学观察如图3所示。室外池塘培育至第8天，对照组大口黑鲈精巢发育至Ⅲ期，切片中显示精小叶有腔隙，小叶边排列着初级精母细胞，腔内有精母细胞和精子(图3A)；同期控温组大口黑鲈精巢处于Ⅱ期，大口黑鲈精巢处于精原细胞增殖后期，精原细胞较多，精小叶内精原细胞成群分布，小叶内仅存有少量精子(图3E)。培育至第24天，对照组大口黑鲈精巢处于Ⅲ期，精巢内精原细胞继续增殖生长，主要以初级精母细胞为主(图3B，3C)，培育至第30天时，精巢处于Ⅳ期末，小叶腔扩大，腔内充满大量精子，染色较深(图3D)；而控温组大口黑鲈精巢发育较为缓慢，培育至第30天仅发育至Ⅲ期(图3F-3H)。

图3 大口黑鲈精巢组织切片观察Fig.3 Observation of testis tissue section of M.salmoides

大口黑鲈卵巢发育组织学如图4所示。室外池塘培育至第8天，对照组大口黑鲈卵巢发育至Ⅲ期，切片显示卵巢内出现液泡，沉积的卵黄开始出现油球，有2层滤泡膜，主要以Ⅲ时相卵母细胞为主(图4E)，而控温组大口黑鲈卵巢内卵黄正处于沉积阶段，细胞核明显(图4A)，此时卵粒不能剥离。培育至第24天，对照组大口黑鲈卵巢体积进一步增大，此时细胞核开始极化，油球增多，卵巢内主要为Ⅳ时相卵母细胞(图4G)，培育至第30天时，此时卵巢处于Ⅴ期，卵黄颗粒处于游离状态(图4H)。控温组大口黑鲈卵巢发育较为缓慢，培育至第24天时，卵母细胞体积慢慢增大，卵黄继续沉积，逐渐出现油球(图4C)，培育至第30天时为Ⅳ期卵巢，卵母细胞进一步增大，细胞核极化，油球数量增加、变大(图4D)。

图4 大口黑鲈卵巢组织切片观察Fig.4 Observation of ovarian tissue section of M.salmoides

2.3 室外培育大口黑鲈血清性激素表达

室外池塘培育期间大口黑鲈血清T水平呈上升趋势(图5)，对照组大口黑鲈血清T水平在1.45～3.13 nmol/L之间；控温组大口黑鲈血清T水平低于对照组，最低为1.05 nmol/L，在室外池塘培育至第15天，血清T水平上升极其缓慢，后显著上升至最高2.54 nmol/L。对照组大口黑鲈血清E2水平呈先缓慢上升后快速上升趋势，其水平为120.28～223.07 ng/L(图6)；而控温组大口黑鲈血清E2水平在室外池塘培育期间呈缓慢上升趋势，水平在76.04～118.95 ng/L之间。在室外池塘培育期间对照组大口黑鲈血清T水平高于控温组，E2水平也高于控温组且第30天存在显著性差异。

图5 雄性大口黑鲈血清中睾酮(T)含量变化Fig.5 Changes of serum testosterone(T)content in male M.salmoides

图6 雌性大口黑鲈血清中雌二醇(E2)含量变化Fig.6 Changes of estradiol(E2)content in serum of female M.salmoides

2.4 大口黑鲈室内低温培育及反季节繁殖

室内低温培育期间大口黑鲈性腺指数(GSI)变化如表1所示。对照组雄性大口黑鲈GSI从0.85%增加至0.90%，控温组雄性大口黑鲈GSI从0.60%增加至0.80%，对照组和控温组之间不存在显著性差异；对照组雌性大口黑鲈GSI从12.22%增加至13.42%，控温组雌性大口黑鲈GSI从9.03%增加至10.23%，对照组雌性大口黑鲈GSI显著高于控温组。组织学表明，室内培育初对照组大口黑鲈精巢内存在大量精子(图7C)，培育至第30天时，精巢仍处于Ⅴ期，精巢内精子染色较深(图7D)；而室内培育初控温组大口黑鲈精小叶内存在不同时期精母细胞和精子(图7A)，培育至第30天时仍处于Ⅳ期(图7B)。卵巢内细胞变化较小，室内培育初对照组大口黑鲈卵巢处于Ⅳ期末至Ⅴ期初(图7E)，控温组大口黑鲈卵巢处于Ⅳ期初，周围还存在Ⅲ时相卵母细胞正在发育(图7G)，培育至第30天时，对照组大口黑鲈卵巢内主要以Ⅴ时相卵母细胞为主(图7F)，控温组大口黑鲈卵巢处于Ⅳ期末，其周围也存有少量Ⅲ时相卵母细胞(图7H)。

图7 控温期大口黑鲈性腺组织切片观察Fig.7 Observation of gonad tissue section of the first instar M.salmoides during the temperature control period

对照组大口黑鲈室内低温培育30 d后升温至20 ℃开始产卵，控温组大口黑鲈室内低温培育60 d后升温至20 ℃开始产卵，结果如表2所示。控温组大口黑鲈总产卵量、受精率高于对照组，孵化率则相反，但二者均不存在显著性差异。

表2 大口黑鲈反季节繁殖Tab.2 M.salmoides breed off-season

3 讨论

3.1 温度对大口黑鲈性腺发育及性激素表达的影响

已有研究报道，温度、激素、营养、pH等是影响鱼类性腺发育的关键因素，其中温度是通过启动下丘脑-垂体-性腺轴的生理功能来发挥作用并调控性腺发育、影响精卵细胞的增殖生长和成熟过程[21，22]。在本研究中，室外池塘培育期间对照组(平均水温14.2 ℃)和控温组(平均水温8.5 ℃)大口黑鲈GSI均呈上升趋势，组织学显示对照组大口黑鲈卵巢从Ⅲ期末培育至第30天时已达Ⅴ期，而控温组大口黑鲈卵巢从Ⅲ期中培育至第30天时卵巢发育至Ⅳ期，这是由于降低温度导致控温组大口黑鲈性腺发育较慢。其中室外池塘培育期间对照组雌性大口黑鲈GSI从17.7 ℃开始显著上升，MARTYNIUK等[23]表明水温达到16.1 ℃时野生大口黑鲈性腺开始发育，GSI显著上升；BROWN等[24]研究发现在美国中西部地区，水温达到13.9 ℃时大口黑鲈性腺开始发育，15 ℃以上GSI显著上升；崔庆奎等[20]在华中地区池塘养殖大口黑鲈的研究中发现，从11.0 ℃开始卵巢中逐渐以Ⅲ时相卵子为主，性腺开始发育，至15 ℃时GSI显著上升，以上研究均表明大口黑鲈性腺发育的临界温度为15 ℃。本研究推测宁夏地区适宜控制大口黑鲈性腺发育的水温在15 ℃以下，进一步进行大口黑鲈室内低温[(14±1)℃]培育研究，发现对照组和控温组雌性大口黑鲈GSI均仅增加了1.20%，其组织学变化特征不明显，证实了控制水温在该温度范围内能够有效延缓大口黑鲈性腺发育。

在硬骨鱼类研究中表明，性类固醇激素(T和E2)在性腺发育成熟过程中起重要的调节作用，其表达变化与GSI密切相关[25]。本研究发现，在大口黑鲈性腺发育过程中，T和E2表达水平与GSI变化均呈现上升趋势，且产卵前对照组大口黑鲈血清性激素与性腺发育显著增加，与BROWN等[24]的研究结果相一致。BROWN等[24]发现大口黑鲈卵巢Ⅲ期卵母细胞向Ⅳ期卵母细胞转换时水温与E2同步上升，在本研究中，对照组和控温组大口黑鲈Ⅳ期卵母细胞出现分别在实验第16天和第30天，同时间水温与E2也在上升，但E2上升趋势不显著，表明鱼类配子的发生受性类固醇激素产生的时间变化影响[12]。

在硬骨鱼类的生殖周期中，温度也会对鱼产卵行为产生影响，其每种鱼都有自己的产卵温度阈值，在适温范围内温度越高，产卵率、受精率越高。而在本研究中，对照组大口黑鲈产卵量、受精率均低于控温组，这可能是由于前期的低温刺激或产卵时的升温造成的影响。

3.2 大口黑鲈反季节繁殖

不同鱼类因为产卵类型及环境不同，繁殖周期和繁殖时间会有所差异，而通过温度调控可调整其繁殖时间及周期。如稀有鲫(Gobiocyprisrarus)在自然条件下的繁殖季节为3-11月，而人工控制条件下可周年繁殖[26]；香鱼(Plecoglossusaltivelis)人工繁殖时间在10-11月，通过人工调控温度实现常年提供苗种、周年养殖[27]。通过温度调控也可使大口黑鲈繁殖时间与周期发生变化，HUSSEIN等[28]发现，华中地区大口黑鲈自然产卵为5月份，将自然产卵后的大口黑鲈转入水泥池用水库深层水(9～12 ℃)培育，使大口黑鲈Ⅱ期卵巢延缓了90天，升温至20 ℃后在秋季的9、10月二次产卵；MATTHEWS等[29]报道，大口黑鲈在佛罗里达州产卵时间为春季，利用控温设备调控水温，先降温，再维持低温(10～12 ℃)，最后升温至产卵温度，在9、10月份获得反季节苗种；崔庆奎等[20]利用地下水将大口黑鲈池塘水温降至[(20±1)℃]，维持该水温至产卵，在9、10月二次产卵。综合上述研究发现，要获得反季节苗种均需降低水温来控制性腺发育，而本研究通过夏季在室内使用循环地下水(12～13 ℃)控温培育30～60 d升温至20 ℃产卵，在6、7月获得了反季节苗种。