缺氧诱导因子-1ɑ及miR-20ɑ-5p在子痫前期患者中的表达及相互作用

高 静,常 畅,李志强,郝文斌,王常娟,周 蕾,钱晓蕾,武海博,王琳冬

(河北北方学院附属第二医院,河北 张家口 075100)

子痫前期是妊娠特异性并发症的一种,其全球发病率为5%～7%［1］。在妊娠20周左右,患有子痫前期的孕妇会出现伴或不伴有蛋白尿的高血压,会导致不良妊娠结局［2］。目前研究认为“两阶段紊乱理论”是导致子痫前期发生发展的机制,着床异常和胎盘缺氧可诱导自由基和缺氧诱导因子-1ɑ(HIF-1ɑ)的产生［3］。其中胎盘缺氧可导致滋养层细胞凋亡,进而影响滋养层的侵袭和螺旋动脉的重塑;HIF-1ɑ高表达可影响胎盘的发育,可导致胎盘滋养层细胞相关疾病［4］,且可诱发可溶性FMS样酪氨酸激酶-1通过胎盘进入母体循环并抑制血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PIGF)的产生,导致母体内皮功能障碍［5］。有证据表明,妊娠期高血压病与不同微小RNA(miRNA)表达的改变有关,miRNA是小的非编码RNA(19～22 nt),参与靶mRNA的转录后调控,其与许多生物学和病理过程密切相关,包括细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生等［6］。其中miR-20ɑ-5p已被证实可作为妊娠糖尿病患者早期筛查的生物标志物［7］,其可通过调控VEGF/Akt轴的激活而参与H2O2诱导的滋养层细胞凋亡［8］。然而miR-20ɑ-5p和HIF-1ɑ在子痫前期中的相关作用仍不清楚,本研究基于生物信息学探讨了二者的表达与子痫前期发生发展的关系及其相互作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月—2019年12月在河北北方学院附属第二医院接受治疗,且符合第 7版《妇产科学》中重度子痫前期临床诊断标准的58例孕妇作为子痫前期组,年龄20～35(26.2±5.1)岁,妊娠(31.77±2.98)周,排除合并慢性高血压、肾病、糖尿病、其他内科疾病及严重的全身性疾病者,临床及随访资料不完整者。另选取同期健康妊娠孕妇56例作为健康组,年龄20～36(26.8±5.3)岁,妊娠(38.17±1.48)周。2组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经河北北方学院附属第二医院伦理委员会批准(2021124D),所有入选者均对研究知情同意。

1.2研究方法 记录2组分娩新生儿体重［按照均数2 495 g分为低体重儿(≤2 495 g)和高体重儿(>2 495 g)］,采用qRT-PCR检测2组孕妇分娩后胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表达情况,分析HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p间的相关性及与子痫前期预后的关系,通过miRDB、TargetScan和miRWalk网站分析二者间的潜在机制。

1.3胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表达检测方法 收集2组孕妇分娩后脐带附着处旁边的胎盘组织200 mg,置于PE管中行qRT-PCR检测。采用ABI PRISM 7500荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,U.S.A),TRIzol试剂(Takara,Qingdao,China)进行RNA的提取;根据说明书的要求采用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser(TakaRa Bio Inc., Shiga,JP)将mRNA反转录为cDNA;采用SuperScripll试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,California,U.S.A)将miRNA反转录为cDNA。相对定量通过GAPDH进行归一化。设计PCR引物序列:miR-20ɑ-5p 上游为5’-ATTTCACGAATATCACGT-3’,下游为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;HIF-1ɑ 上游为5’-CGAAGCCCTGAAAGCG-3’,下游为5’-GGCTGTCCGACTTTGA-3’;GAPDH 上游为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游为5’-TGTAGACCATGTA GTTGAGGTCA-3’。用Sequence Detection Software(version 1.4.0.25)分析软件,以2- ΔΔCt法计算各基因在标本中的表达量。

1.4生物信息学分析方法 为了明确调控HIF-1ɑ的上游miRNA,将HIF-1ɑ分别输入 miRDB(http://mirdb.org)、TargetScan(https:// www.targetscan. org)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)网站(三大网站均是预测哺乳动物mRNA和miRNA靶基因的在线工具)筛选参与调控HIF-1ɑ的靶miRNA,得到的靶miRNA通过FunRich软件(version3.1.3)进行韦恩图分析,采用Cytoscape软件(version3.9.1)进行PPI图绘制。

2 结 果

2.12组娩新生儿体重及胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表达情况 子痫前期组新生儿体重660～4 200 g,健康组新生儿体重2 555～4 260 g;子痫前期组胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p相对表达量均明显高于健康组(P均<0.05),Pearson分析发现二者呈正相关(r=0.466,P<0.05)。见图1。

图1 健康组和子痫前期组胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表达情况及二者相关性

2.2HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表达与子痫前期预后的关系 将年龄、孕周、HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p作为协变量,新生儿体重作为因变量进行Logistics多因素分析,结果HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p高表达、孕周为子痫前期并发不良后果的风险因子(P均<0.05),其中HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p高表达子痫前期者发生新生儿低体重的风险分别是非HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p高表达者的2.351倍和2.074倍,见图2。将新生儿体重作为子痫前期不良因素的预测指标,结果HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p均为子痫前期预后不良的预测因子,二者灵敏度和特异度分别为99.1%,94.6%和100%,94.4%,见图3。

图2 HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p预测子痫前期并发不良后果的风险评估

图3 HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p对子痫前期并发不良后果的预测价值

2.3HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p相关性及其机制miRDB、TargetScan和miRWalk网站调控HIF-1ɑ表达的miRNA分别有36个、1 101个和1 842个,三者共有的miRNA有22个,分别为miR-18ɑ-5P、miR-18b-5p、miR-493-5p、miR-589-3p、miR-580-3p、miR-20ɑ-5P、miR-93-5P、miR-106ɑ-5P、miR-17-5p、miR-330-3p、miR-155-5p、miR-338-5p等,其中miR-20ɑ-5P的上调是导致子痫前期孕妇胎儿生长受限的因素之一,可作为其早期筛查的生物标志物,见图4及图5。通过TargetScan网站分析,HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5P的结合位点是miR-20ɑ-5p第2-8nt与HIF-1ɑ 3’UTR完全配对,见图6。

图4 miRDB、TargetScan和miRWalk工具中HIF-1ɑ靶向miRNA的韦恩图

图5 miRDB、TargetScan和miRWalk工具中HIF-1ɑ共同靶向miRNA的PPI图

图6 HIF-1ɑ和靶miR-20ɑ-5p的结合位点

3 讨 论

子痫前期是妊娠相关的并发症之一,缺氧、免疫和炎症相关通路在子痫前期发生发展中起着重要作用［9］。慢性缺氧可导致子宫胎盘血管阻力增加,诱发血压的变化,促进子痫前期进展［10］。且胎盘缺氧后复氧会导致滋养细胞自噬-溶酶体间关键因子的失衡,加重滋养层细胞的损伤［11］。HIF-1ɑ的过表达提示细胞内缺氧,也是缺氧的重要标志之一［12］。多项研究发现,HIF-1ɑ高表达可介导胎盘的氧化损伤和胎盘应激反应途径的激活,这可能与胎盘内质网池的扩张和抗血管生成因子的表达增加有关,致使血管生成失衡［13-14］。本研究结果显示,子痫前期组胎盘组织中HIF-1ɑ表达量明显高于健康组,且HIF-1ɑ的高表达是导致子痫前期预后不良的风险因素,同时可作为子痫前期新生儿低体重的预测指标,说明缺氧的持续存在不仅诱导子痫前期的发生,而且是导致子痫前期相关不良并发症的潜在风险因素。

miRNA是一类内源性具有调控功能的非编码RNA,参与基因的转录和翻译［15］。相关研究发现,miR-20ɑ-5p/HIF-1ɑ轴的上调可促进结直肠癌细胞的增殖及其有氧糖酵解［16］;在视网膜血管病变中,miR-20ɑ-5p通过介导HIF-1ɑ的表达,进而诱导血管内皮细胞分泌VEGF,促进血管生成［17］;在子痫前期患者中,miR-20ɑ-5p显著上调,其可作为妊娠相关并发症,特别是心血管疾病的危险因子,机制可能与其介导内皮功能障碍有关［18］。本研究发现,子痫前期组胎盘组织中miR-20ɑ-5p表达量明显高于健康组,提示其上调可能是导致子痫前期发生的重要因素,与多项研究结果一致［19-20］;相关性分析显示,miR-20ɑ-5p的上调与HIF-1ɑ高表达有关,二者存在正相关性;通过三大预测靶基因的网站分析,显示miR-20ɑ-5p可调控HIF-1ɑ的表达。当然本研究还有些局限性,HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p仅检测mRNA的水平,还需要深入研究其蛋白水平;HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p的相关性还需要进一步验证。

综上所述,子痫前期孕妇胎盘组织中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p呈高表达,且二者呈正相关性,可作为子痫前期预后不良的预测因子,miR-20ɑ-5p可能通过调控HIF-1ɑ的表达参与子痫前期的发生发展。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。